ГЛАВА 20 МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Г.В. Раменская, С.Н. Кондратенко, Л.М. Красных Анастрозол

Качественное и количественное определение препарата проводили на жидкостном хроматографе «Shimadzu» (Япония) со спектрофотометрическим детектором и интегратором «Chromatopac C-6R» (Япония). Анастрозол растворяли в ацетонитриле.

Подготовка проб. К1 мл плазмы добавляли 5 мл дихлорметана, пробы помещали на горизонтальный шейкер и интенсивно встряхивали в течение 15 мин. Затем пробы центрифугировали при 4500 об/мин, органический слой отбирали в колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 250 мл подвижной фазы и аликвоту объёмом 100 мкл инжектировали в хроматограф.

Хроматографирование. Для детектирования использовали УФ детектор с длиной волны λ=215 нм. Анализ проб проводили на колонке «LC-18-OB», 150x4,5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и 0,01 М КН₂РО₄ (30% и 70% по объёму) с добавлением о-фосфорной кислоты (рН=3,6). Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. В этих условиях время удерживания анастрозола составляло 13,8±0,2 мин.

Установлена линейная зависимость между концентрацией анастрозола в интервале 10-200 нг/мл и высотой хроматографического пика. Концентрацию анастрозола в пробах определяли методом абсолютной калибровки по калибровочной кривой. Предел обнаружения составлял 5 нг/мл.

Атенолол

Реактивы. Субстанция атенолола, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, метанол для жидкостной хроматографии, этилацетат, ледяная уксусная кислота, натрия гидроксид.

Обработка проб. В пробирку, содержащую 1 мл плазмы, добавляли 100 мкл 0,5 М раствора натрия гидроксида и 5 мл этилацетата, экстрагировали 10 мин при интенсивном встряхивании и центрифугировали 10 мин при 1000 g. Затем органический слой количественно переносили в коническую колбу и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 150 мкл мобильной фазы. Аликвоту (50-100 мкл) использовали для хроматографирования.

Хроматографирование. Анализ проводили на модульном высокоэффективном жидкостном хроматографе с флюориметрическим детектором «Kratos» модели FS 970 («Analytical Instruments*, США) при длине волны эмиссии 300 нм, возбуждения - 280 нм. Использовали обращённофазную хроматографическую колонку «μBondapakTM C18», 10 μm, 3,9x300 мм («Waters», США).

Элюирование проводили мобильной фазой, содержащей ацетонитрил, бидистиллированную воду и ледяную уксусную кислоту (40:60:1). Фазу перед анализом профильтровывали через фильтр 0,22 мкм и дегазировали под вакуумом. Скорость потока во время анализа поддерживали 1 мл/мин. Время удерживания пика атенолола составило 7,0 мин.

Количественное определение атенолола в плазме крови проводили методом абсолютной калибровки. Калибровку проводили следующим

образом. К 1 мл плазмы крови, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора атенолола (1 и 10 мкг/мл), чтобы его концентрация в плазме составляла 0, 10, 25, 50, 100, 200 и 300 нг/мл. Затем поступали в соответствии с описанной методикой. В указанном диапазоне концентраций калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация атенолола в плазме крови (нг/мл); х - высота хроматографического пика атенолола.

Коэффициент корреляции r²=0,9910. Предел детектирования атенолола составлял 5 нг/мл плазмы.

Ацетаминофен

Реактивы. Субстанция ацетаминофена^р (N-ацетил-р-аминофенол) и внутреннего стандарта (2-ацетамидофенол), метанол для жидкостной хроматографии, бария гидроксид, цинка сульфат, вода бидистиллированная.

Обработка проб. К 200 мкл плазмы крови добавляли 50 мкл раствора внутреннего стандарта (100 мкг/мл) и 750 мл деионизированной воды, смешивали на «Vortex»-мешалке в течение 2 мин и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 1 мл 0,3 N раствора бария гидроксида, смешивали на «Vortex»-мешалке в течение 2 мин, после чего добавляли 1 мл 0,3 N раствора цинка сульфата и вновь смешивали на «Vortex»-мешалке в течение 2 мин. После центрифугирования (10 мин при 3000 об/мин) супернатант фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, 50-100 мкл фильтрата использовали для хроматографирования.

Хроматографирование. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» при длине волны 254 нм. Использовали обращённофазную хроматографическую колонку «μBondapakTM C18»,10 μm, 10 μm, 3,9x300 мм («Waters», США).

Элюирование проводили мобильной фазой, содержащей по объёму 20% метанола. Фазу перед анализом профильтровывали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и дегазировали под вакуумом. Скорость потока во время анализа поддерживали 1,3 мл/мин.

Время удерживания ацетаминофена^р составило 3,6 мин, а внутреннего стандарта - 5,6 мин.

Количественное определение ацетаминофена^р в плазме проводили методом внутреннего стандарта с использованием 2-ацетамидофе- нола.

Для калибровки к 200 мкл плазмы, не содержащей ацетаминофена^р, добавляли 0, 10, 20, 40, 60, 100, 140 и 180 мкл стандартного раствора ацетаминофена^р (10 мкг/мл), по 50 мкл раствора внутреннего стандарта и соответственно 750, 740, 730, 710, 690, 650, 610, 570 мкл деионизированной воды. Таким образом, концентрация ацетаминофена^р в образцах слюны составляла соответственно 0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 7 и 9 мкг/мл.

В указанном диапазоне концентрации калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация ацетаминофена^р в плазме крови (мкг/мл); х - отношение площадей хроматографических пиков ацетаминофена^р и внутреннего стандарта.

Коэффициент корреляции r²=0,99795. Предел детектирования ацетаминофена^р - 0,2 мкг/мл плазмы.

Варфарин

Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Gilson». Стандартные растворы варфарина готовили в этиловом спирте.

Подготовка проб. К 1 мл плазмы добавляли 200 мкл 1 М Н3РО4, энергично встряхивали на мешалке «Vortex» и экстрагировали в 5 мл хлороформа. Затем пробы центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин. Органический слой отбирали в колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы и аликвоту объёмом 100 мкл инжектировали в хроматограф.

Хроматографирование. Анализ проводили методом УФ-детекции с длиной волны λ=308 нм. Колонка - «Nucleosil 100 С8» (250x4,5 мкм). Элюент состоял из смеси ацетонитрила и 0,05 М КН₂РО₄ 40% и 60% по объёму. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. Время удерживания варфарина - 9,8 мин.

Установлена линейная зависимость между концентрацией варфарина в интервале 0,1-3 мкг/мл и высотой хроматографического пика. Концентрацию этого соединения в пробах определяли методом абсолютной калибровки с пределом обнаружения 0,1 мкг/мл.

Гидрохлортиазид

Анализировали препарат на жидкостном хроматографе фирмы «Shimadzu» (Япония). Стандартные растворы готовили в ацетонитриле.

Подготовка проб. К1 мл плазмы добавляли 0,5 мл 1 М Na₂CO₃, энергично встряхивали на мешалке «Vortex». Затем добавляли 5 мл этилацетата и пробы встряхивали в течение 10 мин. Далее пробы центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин. Органический слой отбирали в колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 150 мкл подвижной фазы, и аликвоту объ- ёмом 50 мкл инжектировали в хроматограф.

Хроматографирование. Для детектирования использовали спектрофотометрический детектор (УФ) при длине волны λ=275 нм. Анализ проводили на колонке «Диасфер 500-П» (Россия), длиной 150 мм, внутренним диаметром 4 мм, зернением 5 мкм. Элюент состоял из смеси 0,02 М фосфатного буфера (рН=3,3) и ацетонитрила 83% и 17% по объёму. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. Время удерживания гидрохлортиазида - 7,5±0,2 мин.

Чувствительность метода - 25 нг/мл, линейный диапазон определяемых концентраций гидрохлортиазида находится в интервале от 25 до 350 нг/мл. Концентрацию этого соединения определяли методом абсолютной калибровки.

Глибенкламид

Реактивы. Глибенкламид, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, бензол, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, кислота соляная, вода бидистиллированная. Стандартные растворы глибенкламида были приготовлены растворением в метаноле; их хранили при 4 °С.

Обработка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 100 мкл 0,1 N раствора HCl и 5 мл бензола. Экстракцию проводили в течение 10 мин при интенсивном встряхивании, затем пробы центрифугировали 10 мин. Органическую фазу количественно переносили в коническую колбу и упаривали досуха на роторном испарителе под вакуумом.

Сухой остаток растворяли в 200 мкл, аликвоту (100 мкл) использовали для хроматографирования.

Хроматографирование. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» и аттенюацией 2 при длине волны 225 нм. Использовали хроматографическую колонку «Диасорб 130-С16Т» 150x4 мм («Биохиммак», Россия) с размером частиц 6 мкм.

Мобильная фаза состояла из смеси ацетонитрила и фосфатного буферного раствора (рН=7) в объёмном соотношении 3:7, а скорость потока элюента составляла 1,2 мл/мин. Время удерживания глибенкламида составило 12,8 мин.

Количественное определение глибенкламида в плазме крови проводили методом абсолютной калибровки. Для этого готовили серию калибровочных проб из плазмы, не содержащей препарата, в которые добавляли стандартный раствор в таком количестве, чтобы концентрация глибенкламида в них составляла 0, 10, 25 , 50, 75, 100, 150, 20 0 и 300 нг/мл плазмы, что соответствует уровню препарата в плазме крови больных при обычном режиме дозирования. В указанном диапазоне концентрации калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация глибенкламида в плазме крови (нг/мл); х - площадь хроматографического пика глибенкламида.

Коэффициент корреляции r²=0,9967. Предел детектирования глибенкламида - 10 нг/мл плазмы.

Диклофенак

Концентрацию диклофенака в плазме крови человека определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Подготовка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 200 мкл 1 М Н₃РО₄, перемешивали на мешалке «Vortex» 10 с, затем прибавляли 5 мл хлороформа и экстрагировали 15 мин на шейкере. После этого пробы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин. Органический слой переносили в конические колбы и упаривали под вакуумом при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл подвижной фазы и аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа.

Хроматографирование. Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Hewlett-Pakard» с УФ-детектором при длине волны λ=280 нм. Элюирование проводили мобильной фазой состава - ацетонитрил и 0,2 М NaH₂PO₄ в соотношении 40:60. Мобильную фазу перед использованием дегазировали под вакуумом. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. Время выхода пика диклофенака - 6,3 мин.

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по площади пика. Калибровочная зависимость в диапазоне концентраций 200-1500 нг/мл носила линейный характер. Чувствительность метода - 100 нг/мл.

Дипиридамол

Для анализа использовали хроматограф «Shimadzu» со спектрофотометрическим детектором и интегратором (CR-6A).

Подготовка проб. К 1 мл плазмы добавляли 200 мкл 2 М NaOH, энергично встряхивали на мешалке «Vortex». Добавляли 5 мл хлороформа, пробы помещали на горизонтальный встряхиватель на 15 мин. Затем центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин, органический слой отбирали в колбы и упаривали при 37 °С на роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы, 100 мкл анализировали на хроматографе.

Хроматографирование. Для анализа использовали УФ-детекцию с длиной волны λ=280 нм. Анализ проводили на хроматографической колонке «Диасфер 110-С18» (150x4,6 мм, 5 мкм). Элюент состоял из 43% ацетонитрила и 57% 0,01 М фосфатного буфера с рН=7 (63 мл К₂НРО₄ + 37 мл КН₂РО₄). Скорость элюирования равнялась 1 мл/мин. Время удерживания дипиридамола - 5,2±0,2 мин.

Концентрацию дипиридамола в пробах определяли методом абсолютной калибровки по калибровочной кривой. Предел обнаружения составлял 50 нг/мл.

Домперидон

Исследования проводили на жидкостном хроматографе «Shimadzu» (Япония) с использованием спектрофлуориметрического детектора (RF-530) и интегратора.

Подготовка проб. К 1 мл сыворотки крови добавляли 100 мкл 2 М NaOH. Затем образцы энергично встряхивали на мешалке «Vortex» и экстрагировали 5 мл хлороформа. Далее пробы центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин, органический слой переносили в

колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 100 мкл подвижной фазы. Аликвоту объёмом 50 мкл инжектировали в хроматограф.

Хроматографирование. Для детектирования использовали спектрофлуориметрический детектор при длине волны поглощения λ=282 нм и длине волны излучения λ=328 нм.

Аналитическая хроматографическаяколонка (фирмы«Биохиммак», Россия) из нержавеющей стали, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4 мм, с обращённофазным сорбентом «Диасфер-110-С18», зернением 5 мкм. Подвижная фаза состояла из 30% ацетонитрила и 70% 0,01 М КН₂РО₄ по объёму. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Время удерживания домперидона - 6,2±0,2 мин.

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки. Калибровочная кривая носила линейный характер в интервале 0,5-155 нг/мл. Предел обнаружения при этих условиях - 0,5 нг/мл.

Ибупрофен

Хроматографическое разделение проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Shimadzu» с УФ-детектором.

Подготовка проб. К 1 мл сыворотки крови добавляли 200 мкл 1М Н₃РО₄ и энергично встряхивали 10 с на мешалке «Vortex». Затем прибавляли 5 мл хлороформа и встряхивали в течение 10 мин. Далее пробы центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин. Органический слой переносили в конические колбы и упаривали под вакуумом. Сухой остаток растворяли в 150 мкл подвижной фазы и 100 мкл инжектировали в хроматограф.

Хроматографирование. Анализ проводили на УФ-детекторе с длиной волны λ=222 нм. При этом использовали колонку «Separon SGX C18» (150x3,3 мм, 5 мкм). Элюирование проводили мобильной фазой: метанол-вода (220:100, рН=3,0). Скорость элюирования составляла 1 мл/мин.

Концентрацию ибупрофена определяли методом абсолютной калибровки.

Индапамид

В исследовании использовали жидкостной хроматограф «Gilson» с УФ детектором и интегратором Chromatopac C-3R (Япония). Индапамид растворяли в ацетонитриле.

Подготовка проб. К 0,5 мл сыворотки крови добавляли 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН=7). Затем образцы энергично встряхивали на мешалке «Vortex» и экстрагировали 2,5 мл диэтилового эфира. Для этого пробы помещали на 10 мин на горизонтальный встряхиватель. Затем пробы центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин и помещали их в морозилку (35 °С) на 7-10 мин. Органический слой отбирали в колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл подвижной фазы. Объём вводимой в хроматограф пробы составлял 100 мкл.

Хроматографирование. Для детектирования использовали спектрофотометрический детектор при длине волны λ=240 нм. В анализе использовали колонку «Nucleosil 100-5 C 18», 5 мкм, 250x3,9 мм. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила (65 мл) и 0,05 М КН₂РО₄ с добавлением о-фосфорной кислоты (рН=3,8). Скорость потока - 0,6 мл/мин. Время удерживания - 6,4±0,2 мин.

Концентрацию изучаемого вещества в образцах вычисляли по методу абсолютной калибровки. Установлена линейная зависимость между концентрацией индапамида в интервале 5-500 нг/мл и отношением высот хроматографических пиков.

Карведилол

Реактивы. Субстанция карведилола, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, диэтиловый эфир, натрия гидроксид, концентрированная о-фосфорная кислота, вода бидистиллированная. Стандартные растворы карведилола готовили растворением в метаноле и хранили при 4 °С.

Обработка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 100 мкл 1 М раствора натрия гидроксида и 7 мл диэтилового эфира, экстрагировали 10 мин при интенсивном встряхивании в завинчивающихся пробирках. Затем водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин). Затем пробы помещали в морозильную камеру (-30 °С) до замораживания водного слоя (20 мин), затем органическую фазу количественно переносили в конические колбы и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 150 мкл элюента, фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа.

Хроматографический анализ. Анализ проводили на модульном высокоэффективном жидкостном хроматографе с флюориметрическим

детектором «Kratos» модели «FS 970» («Analytical Instruments», США) при длине волны эмиссии 340 нм, возбуждения - 285 нм. Использовали обращённофазную хроматографическую колонку «μBondapakTM C18», 10 μm, 3,9x300 мм («Waters», США).

Элюирование проводили мобильной фазой, состоящей из ацетонитрила и 0,2% раствора фосфорной кислоты в объёмном соотношении 2:3. Скорость элюирования составляла 1,3 мл/мин. Время удерживания карведилола в данных условиях - 7,0 мин.

Количественное определение карведилола в плазме крови выполняли методом абсолютной калибровки. К 1 мл плазмы крови, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора карведилола (1 и 10 мкг/мл), чтобы его концентрация в плазме составляла 0, 5, 10, 25, 50, 100, 200 и 300 нг/мл. Далее поступали в соответствии с описанной методикой. В указанном диапазоне концентраций калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация карведилола в плазме крови (нг/мл); х - высота хроматографического пика карведилола.

Коэффициент корреляции r²=0,9910. Предел детектирования карведилола - 2 нг/мл плазмы.

Лансопразол

Реактивы. Субстанция лансопразола, омепразола, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, метанол для жидкостной хроматографии, хлороформ, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат. Стандартные растворы лансопразола и омепразола готовили растворением в метаноле и хранили при 4 °С.

Обработка проб. В пробирку, содержащую 1 мл плазмы, добавляли 50 мкл внутреннего стандарта (раствор омепразола в метаноле с концентрацией 10 мкг/мл), 1 мл фосфатного буферного раствора (рН=8) и 8 мл хлороформа, затем проводили экстракцию в течение 10 мин при интенсивном встряхивании; водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин при 1000 g). Затем водный слой отбрасывали с помощью «ловушки», а органический слой количественно переносили в коническую колбу и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37 °С. Сухой оста-

ток растворяли в 150-200 мкл мобильной фазы. Аликвоту (100 мкл) использовали для хроматографирования.

Хроматографирование. Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) со спектрофотометрическим детектором «Series 1050» и интегратором «HP 3396 Series II» при длине волны 285 нм. Использовали хроматографическую колонку «Диасорб 130- С16Т» 150x4 мм («Биохиммак», Россия) с размером частиц 6 мкм.

Элюирование проводили мобильной фазой, содержащей по объёму 30% ацетонитрила и 70% 0,05 М фосфатного буфера (рН=7,0). Фазу перед анализом профильтровывали через фильтр 0,22 мкм и дегазировали под вакуумом. Во время анализа скорость потока поддерживали 1 мл/мин. Время удерживания омепразола составило 7,1 мин, лансопразола - 13,9 мин.

Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта. Стандартная калибровочная прямая была построена по результатам анализа образцов не содержащей препарата плазмы, в которые добавляли 500 нг омепразола и 50-2000 нг лансопразола, что приблизительно соответствует диапазону его концентраций в плазме крови больных при обычном режиме дозирования (0, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500 и 2000 нг/мл). В указанном диапазоне концентрации калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация лансопразола в плазме крови (нг/мл); х - отношение площадей хроматографических пиков лансопразола и внутреннего стандарта (омепразола).

Коэффициент корреляции r²=0,9985. Предел детектирования лансопразола - 15 нг/мл плазмы.

Летрозол

Количественное определение летрозола проводили на жидкостном хроматографе «Gilson» со спектрофотометрическим детектором и интегратором (CR-3A).

Подготовка проб. К 1 мл сыворотки крови добавляли 1 М NaOH и энергично встряхивали на мешалке «Vortex». Затем в пробы добавляли 5 мл хлороформа и помещали на горизонтальный встряхиватель на 15 мин. Далее пробы центрифугировали при 4500 об/мин, отбирали

органический слой в колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы. Объём вводимой в хроматограф пробы - 100 мкл.

Хроматографирование. Длина волны УФ детектора λ=230 нм. Колонка - «Nova-PakC 18», 300×3,9 мм, 5 мкм («Waters»). Элюент состоял из смеси ацетонитрила и 0,01 М КН₂РО₄ 34% и 66% по объёму. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. Время удерживания летрозола - 8,5±0,2 мин.

Чувствительность метода составляет 5 нг/мл, линейный диапазон определяемых концентраций летрозола находится в интервале от 5 до 100 нг/мл. Концентрацию этого соединения в пробах определяли методом абсолютной калибровки.

Метилпреднизолон

Качественное и количественное определение метилпреднизолона проводили на жидкостном хроматографе «Gilson» со спектрофотометрическим детектором. Препарат растворяли в этиловом спирте.

Подготовка проб. К 1 мл плазмы добавляли 200 мкл 0,1 NaOH, энергично встряхивали на мешалке «Vortex». Затем пробы экстрагировали 5 мл дихлорметана. Для этого их помещали на горизонтальный встряхиватель на 15 мин. Затем этого пробы центрифугировали при 4500 об/мин, органический слой отбирали в колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл подвижной фазы и 100 мкл инжектировали в хроматограф.

Хроматографирование. Для детектирования использовали УФдетекцию с длиной волны λ=254 нм, колонку «Nucleosil 100-5C8». В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила, воды и уксусной кислоты 25%, 75% и 5% по объёму. Скорость потока составляла 0,8 мл/мин. Время удерживания метилпреднизолона - 11,1±0,2 мин.

Количественный анализ препарата проводили методом абсолютной калибровки. Установлена линейная зависимость между концентрацией метилпреднизолона в интервале 5-100 нг/мл.

Метронидазол

Реактивы. Субстанция метронидазола, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, метанол для жидкостной хроматографии, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, вода бидистиллированная.

Обработка проб. К 200 мкл плазмы крови добавляли 1 мл метанола, перемешивали на «Vortex»-мешалке 1 мин, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Аликвоту (25-50 мкл) супернатанта использовали для хроматографирования.

Хроматографирование. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» при длине волны 320 нм и аттенюации 3. Использовали обращён- нофазную хроматографическую колонку «Диасорб 130-С16Т»; 6 μm; 150x 4 мм (АО «Биохиммак», Россия).

Элюирование проводили мобильной фазой, состоящей из ацетонитрила и 0,05 М фосфатного буфера в объёмном соотношении 1,5:8,5. Скорость элюирования - 1 мл/мин. Время удерживания метронидазола - 3,0 мин.

Количественное определение метронидазола в плазме крови проводили методом абсолютной калибровки. Для этого к 1 мл плазмы крови, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора метронидазола (100 и 1000 мкг/мл), чтобы его концентрация в плазме составляла 0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 7 и 10 мкг/мл. Затем поступали в соответствии с описанной методикой. В указанном диапазоне концентраций калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация метронидазола в плазме крови (мкг/мл); х - площадь хроматографического пика метронидазола.

Коэффициент корреляции r²=0,9982. Предел детектирования метронидазола - 0,1 мкг/мл плазмы.

Моксифлоксацин

Реактивы. Субстанция моксифлоксацина, хлороформ, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, вода бидистиллированная. Стандартные растворы готовили растворением моксифлоксацина в воде и хранили при 4 °С.

Обработка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 1 мл 0,01 М фосфатного буфера и 8 мл хлороформа, экстрагировали 10 мин при интенсивном встряхивании в завинчивающихся пробирках. Затем водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин

при 3000 об/мин). После чего плазму крови отбрасывали с помощью «ловушки», а органическую фазу количественно переносили в коническую колбу и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 150 мкл элюента. Аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа.

Хроматографический анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» при длине волны 310 нм. Использовали обращённофазную хроматографическую колонку «Phenomenex RP-18» (150x3,2 мм) с размером частиц 5 мкм.

Элюирование проводили мобильной фазой, состоящей из смеси ацетонитрила и 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН=3,1) в объ- ёмном соотношении 5:25. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. Время выхода моксифлоксацина в данных условиях - 11,8 мин.

Количественное определение моксифлоксацина в плазме крови проводили методом абсолютной калибровки. Для этого к 1 мл плазмы крови, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора моксифлоксацина, чтобы его концентрация в плазме составляла 0, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3 и 5 мкг/мл. Затем поступали в соответствии с описанной методикой. В указанном диапазоне концентраций калибровочная зависимость была линейной. Коэффициент корреляции r²=0,997. Предел детектирования моксифлоксацина - 20 нг/мл плазмы.

Нифедипин

В связи с чрезвычайной чувствительностью нифедипина к свету все процедуры количественного анализа проводили в затемнённом помещении - в условиях, исключающих попадание света (λ<420 нм). Кроме того, пробирки и конические колбы, используемые для анализа, оборачивали фольгой.

Реактивы. Субстанция нифедипина, субстанция нисолдипина, метанол для жидкостной хроматографии, хлороформ, гексан, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, натрия гидроксид, натрия дигидрофосфат, вода бидистиллированная. Стандартные растворы готовили растворением в метаноле и хранили при 4 °С.

Обработка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 75 мкл раствора внутреннего стандарта - нисолдипина (10 мкг/мл), перемешивали и выдерживали при комнатной температуре 2 мин. Затем в пробу

добавляли 200 мкл 1 М раствора NaOH и 5 мл смеси хлороформ-гек- сан (3:7), экстрагировали 10 мин при интенсивном встряхивании в завинчивающихся пробирках. Затем водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин 3000 об/мин). После чего пробу замораживали при -25 °С в течение 10 мин. Затем органическую фазу количественно переносили в коническую колбу и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 120 мкл элюента. Аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа.

Хроматографирование. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» при длине волны 238 нм и аттенюации 3. Использовали обращён- нофазную хроматографическую колонку «Spherisorb, ODS-2»; 5 мм; 150x4,6 мм («Sigma», США).

Элюирование проводили мобильной фазой, состоящей из ацетонитрила и 0,15 М раствора NaH₂PO₄ в объёмном соотношении 45:55. Скорость элюирования составляла 1,5 мл/мин. Время удерживания нифедипина составило 5,2 мин, а внутреннего стандарта - 10,8 мин.

Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта с использованием нисолдипина. Калибровочная прямая была построена по результатам анализа образцов плазмы крови, содержащих 10-200 нг/мл нифедипина (0, 10, 25, 50, 75, 100, 150 и 200 нг/мл). В указанном диапазоне концентрации калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация нифедипина в плазме крови (нг/мл); х - отношение площади хроматографического пика нифедипина к площади хроматографического пика внутреннего стандарта.

Коэффициент регрессии r²=0,999 885. Предел детектирования нифедипина составлял 5 нг/мл плазмы.

Омепразол

Реактивы. Субстанция омепразола, лансопразола, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, метанол для жидкостной хроматографии, хлороформ, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат.

Стандартные растворы омепразола и лансопразола готовили растворением в метаноле и хранили при 4 °С.

Обработка проб. В пробирку, содержащую 1 мл плазмы, добавляли 50 мкл внутреннего стандарта (раствор лансопразола в метаноле с концентрацией 10 мкг/мл), 1 мл фосфатного буферного раствора (рН=8) и 8 мл хлороформа, экстрагировали 10 минут при интенсивном встряхивании и центрифугировали 10 минут при 1000 g. Затем водный слой отбрасывали с помощью «ловушки», а органический слой количественно переносили в коническую колбу и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 150-200 мкл мобильной фазы. Аликвоту (100 мкл) использовали для хроматографирования.

Хроматографирование. Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) со спектрофотометрическим детектором «Series 1050» и интегратором «HP 3396 Series II» при длине волны 302 нм. Использовали хроматографическую колонку «Диасорб 130- С16Т» 150x4 мм («Биохиммак», Россия) с размером частиц 6 мкм.

Элюирование проводили мобильной фазой, содержащей по объёму 30% ацетонитрила и 70% 0,05 М фосфатного буфера (рН=7,0). Фазу перед анализом профильтровывали через фильтр 0,22 мкм и дегазировали под вакуумом. Во время анализа скорость потока поддерживали 1 мл/мин. Время удерживания омепразола составило 7,1 мин, лансопразола - 13,9 мин.

Количественное определение омепразола в плазме крови проводили методом внутреннего стандарта с использованием лансопразола. Для калибровки к 1 мл плазмы крови, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора омепразола (1 и 10 мкг/мл), чтобы его концентрация в плазме составляла 0, 50, 100, 250, 500, 1000, 1500 и 2000 нг/мл. Затем поступали в соответствии с описанной методикой (см. выше «Обработка проб»). В указанном диапазоне концентраций калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация омепразола в плазме крови (нг/мл); х - отношение площадей хроматографических пиков омепразола и внутреннего стандарта (лансопразола).

Коэффициент корреляции r²=0,9956. Предел детектирования омепразола составлял 15 нг/мл плазмы.

Офлоксацин

Реактивы. Субстанция офлоксацина, хлороформ для жидкостной хроматографии, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, концентрированная уксусная кислота, натрия ацетат, водный раствор аммиака 25%, вода бидистиллированная.

Обработка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 0,5 мл фосфатного буфера (рН=7,0) и 7 мл хлороформа, экстрагировали 10 мин при интенсивном встряхивании в завинчивающихся пробирках. Затем водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин). После чего плазму крови отбрасывали с помощью «ловушки», а органическую фазу количественно переносили в пробирку, содержащую 250 мкл 1% водного раствора аммиака, перемешивали на «"Vortex»-мешалке 1 мин и после краткого центрифугирования (2 мин) аликвоту (100 мкл) водной фазы использовали для хроматографирования.

Хроматографический анализ. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» при длине волны 313 нм и аттенюации 3. Использовали обращённофазную хроматографическую колонку «Диасорб 130-С16Т»; 6 μm; 150×4 мм (АО «Биохиммак», Россия).

Элюирование проводили мобильной фазой, состоящей из ацетонитрила и 0,15 М ацетатного буфера (рН=3) в объёмном соотношении 1:4. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. Время удерживания офлоксацина - 6,5 мин.

Количественное определение офлоксацина в плазме крови проводили методом абсолютной калибровки. К 1 мл плазмы крови, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора офлоксацина (10 и 100 мкг/мл), чтобы его концентрация в плазме составляла 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 5, 7 и 10 мкг/мл. Далее поступали в соответствии с описанной методикой. В указанном диапазоне концентраций калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация офлоксацина в плазме крови (нг/мл); х - площадь хроматографического пика офлоксацина.

Коэффициент корреляции r²=0,9996. Предел детектирования офлоксацина - 50 нг/мл плазмы.

Пиоглитазон

Анализировали препарат на жидкостном хроматографе «Gilson» со спектрофотометрическим детектором. Субстанцию пиоглитазона растворяли в смеси метанол/ацетонитрил (50:50).

Подготовка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 0,5 мл насыщенного раствора NaHCO₃, энергично встряхивали на мешалке «Vortex». Затем пробы экстрагировали 6 мл хлороформа. После этого образец центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин. Органический слой отбирали в колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 150 мкл подвижной фазы и аликвоту объ- ёмом 50 мкл наносили на колонку хроматографа.

Хроматографирование. Анализ проб проводили при длине волны λ=269 нм на колонке «Nova-Pac C 18», длиной 300 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм. Элюент состоял из смеси ацетонитрила и 0,05 М КН₂РО₄ 40% и 60% по объёму. Скорость элюирования равнялась 1 мл/мин. Время удерживания препарата в этих условиях составило 8,5±0,2 мин.

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки. Установлена линейная зависимость пиоглитазона в интервале концентраций от 25 до 1200 нг/мл. Чувствительность метода - 25 нг/мл.

Пиразинамид

Анализ пиразинамида проводили на жидкостном хроматографе «Gilson» с УФ детектором и интегратором «Chromatopac C-3R» (Япония). Пиразинамид растворяли в метаноле.

Подготовка проб. К 1 мл плазмы добавляли 5 мл хлороформа и встряхивали в течение 15 мин на шейкере. Затем пробы центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин. Органический слой отбирали в колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 300 мкл подвижной фазы. Аликвоту объёмом 50 мкл инжектировали в хроматограф.

Хроматографирование. Для детектирования использовали спектрофотометрический детектор λ=267 нм, колонку «BDS Hypersil C18», 250x4,6, 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали смесь из 100 мл 0,1 М КН₂РО₄ и 2 мл ацетонитрила_. Скорость потока состав-

ляла 1 мл/мин. В этих условиях время удерживания пиразинамида - 8,0±0,2 мин.

Количественный анализ проводили методом абсолютной калибровки. Линейную зависимость наблюдали в диапазоне концентраций пиразинамида от 0,10 до 10 мкг/мл. Предел обнаружения составлял 0,5 мкг/мл.

Пропранолол

Реактивы. Пропранолола гидрохлорид, триэтиламин («Sigma», США), ацетонитрил, дихлорметан, диэтиловый эфир, ортофосфорная кислота, серная кислота, натрия гидроксид. В качестве внутреннего стандарта использовали празозина гидрохлорид. Все стандартные растворы готовили растворением в бидистиллированной воде и хранили при 4 °С.

Обработка проб. В пробирку с 1 мл плазмы добавляли 200 мкл 1 М раствора NaOH, 60 мкл внутреннего стандарта (раствор 50 нг празозина в 100 мкл воды) и 5 мл экстрагента (смесь диэтилового эфира и дихлорметана в соотношении 4:1 по объёму). Экстракцию проводили в течение 10 мин при интенсивном встряхивании, затем пробы центрифугировали 10 мин при 500 g, после чего охлаждали до -35 °С. Когда водный слой замерзал, надосадочный экстракт переливали в конические пробирки, содержащие 100 мкл 0,1 N раствора серной кислоты и встряхивали на «Vortex»-мешалке в течение 1 мин. После краткого центрифугирования 50 мкл кислотного слоя использовали для хроматографирования.

Хроматографирование. Анализ проводили на модульном жидкостном хроматографе с помпой «Beckman» 114М («Beckman Instruments», США) и флюориметрическим детектором «FS 970» («Kratos Analytical Instruments», США) при длине волны возбуждения 276 нм, длине волны эмиссии 340 нм, чувствительности 0,2 мА и аттенюации 10 мВ. Использовали обращённофазную хроматографическую колонку «μBondapakTMC18», 10 μη, 3,9×300 мм («Waters», США).

Элюирование проводили мобильной фазой, содержащей по объёму 40,6% ацетонитрила, 58% бидистиллированной воды, 0,9% ортофосфорной кислоты, 0,5% триэтиламина. Скорость потока во время анализа поддерживали 1,5 мл/мин.

Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта с использованием празозина. Стандартная калибровочная кривая была построена по результатам анализа образцов «чистой»

плазмы, содержащих 30 нг празозина и 20-400 нг пропранолола, что соответствует диапазону его концентраций в плазме крови больных при обычном режиме дозирования. В указанном диапазоне калибровочная зависимость имела линейный характер. Предел детектирования пропранолола составлял 5 нг/мл плазмы.

Протионамид

Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Gilson». Стандартные растворы готовили в ацетонитриле.

Подготовка проб. К 0,5 мл сыворотки крови добавляли 3 мл хлороформа. Пробы помещали на горизонтальный встряхиватель на 15 мин и затем центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин. Органический слой отбирали в колбы и упаривали на роторном испарителе при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы и аликвоту объёмом 100 мкл инжектировали в хроматограф.

Хроматографирование. Для детектирования использовали спектрофотометрический ультрафиолетовый детектор при длине волны λ=254 нм. В анализе использовали хроматографическую колонку «Nucleosil 100-5С-18», 250×3,9 мм, 5 мкм. Элюент состоял из смеси ацетонитрила и 0,01 М КН₂РО₄ 25% и 75% по объёму, соответственно. Скорость элюирования равнялась 1 мл/мин. Время удерживания протионамида - 10±0,2 мин.

Концентрацию протионамида определяли методом абсолютной калибровки по соответствующей калибровочной кривой. Чувствительность метода - 50 нг/мл. Линейная зависимость протионамида установлена в интервале 0,1-7,0 мкг/мл.

Рабепразол

Реактивы. Субстанция рабепразола, ацетонитрил для жидкостной хроматорафии, метанол для жидкостной хроматографии, хлороформ, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, триэтиламин. Стандартные растворы рабепразола готовили растворением в метаноле и хранили при 4 °С.

Обработка проб. В пробирку, содержащую 1 мл плазмы, добавляли 8 мл хлороформа, экстрагировали 10 мин при интенсивном встряхивании, водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин при 1000 g). Затем водный слой отбрасывали с помощью «ловушки», а органический слой количественно переносили в кони-

ческую колбу и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл мобильной фазы. Аликвоту (100 мкл) использовали для хроматографирования.

Хроматографирование. Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) со спектрофотометрическим детектором «Series 1050» и интегратором «HP 3396 Series II» при длине волны 288 нм. Использовали хроматографическую колонку «Диасорб 130- С16Т» 150x4 мм («Биохиммак», Россия) с размером частиц 6 мкм.

Элюирование проводили мобильной фазой, состоящей из смеси ацетонитрила, 0,05 М фосфатного буфера (рН=7,0) и триэтиламина в объёмном соотношении 81:18,9:0,1. Скорость потока во время анализа поддерживали 1,3 мл/мин. Время выхода пика рабепразола - 4,5 мин.

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки. Калибровочный график зависимости площади хроматографического пика рабепразола от содержания препарата в плазме крови строили по результатам анализа образцов не содержащей препарата плазмы, в которые добавляли рабепразол в количествах, приблизительно соответствующих диапазону его концентрации в плазме крови больных при обычном режиме дозирования (0, 50, 100, 200, 300, 500, 600, 800 и 1000 нг/мл). В указанном диапазоне концентрации калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация рабепразола в плазме крови (нг/мл); х - площадь хроматографического пика рабепразола.

Коэффициент корреляции r²=0,9968. Предел детектирования рабепразола - 15 нг/мл плазмы.

Ранитидин

Реактивы. Субстанция ранитидина, хлороформ для жидкостной хроматографии, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, диэтиловый эфир, натрия гидроксид, калия хлорид, концентрированная уксусная кислота, вода бидистиллированная. Стандартные растворы ранитидина готовили растворением в бидистиллированной воде и хранили при 4 °С.

Обработка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 100 мкл 1 М раствора NaOH и 5 мл смеси хлороформа и диэтилового эфира (4:1), экс-

тракцию проводили в течение 10 мин при интенсивном встряхивании в завинчивающихся пробирках. Затем водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин). После чего водный слой отбрасывали с помощью «ловушки», а органическую фазу количественно переносили в коническую колбу и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 150 мкл элюента, фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Аликвоту (100 мкл) наносили на колонку хроматографа.

Хроматографирование. Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» и аттенюацией 2 при длине волны 320 нм. Использовали хроматографическую колонку «Диасорб 130-С16Т» 150x4 мм («Биохиммак», Россия) с размером частиц 7 мкм.

Элюент состоял из смеси ацетонитрила, 2% раствора KCl и уксусной кислоты в объёмном соотношении 1:9:0,01, а скорость элюирования поддерживали 1 мл/мин. Время удерживания пика ранитидина составило 10,8 мин.

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки. Калибровочный график зависимости площади хроматографического пика ранитидина от содержания препарата в плазме крови строили по результатам анализа образцов не содержащей препарата плазмы, в которые добавляли ранитидин в количествах, приблизительно соответствующих диапазону его концентрации в плазме крови больных при обычном режиме дозирования (0, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 и 1500 нг/мл). В указанном диапазоне концентрации калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация ранитидина в плазме крови (нг/мл); х - площадь хроматографического пика ранитидина.

Коэффициент корреляции r²=0,99884. Предел детектирования ранитидина - 15 нг/мл плазмы.

Тилорон

Качественное и количественное определение тилорона проводили с использованием жидкостного хроматографа «Shimadzu» (Япония) с УФ детектором и интегратором «Chromatopac C-6A».

Подготовка проб. К1 мл сыворотки крови добавляли 5 мл хлороформа. Пробы помещали на горизонтальный встряхиватель на 15 мин и затем центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 мин. Органический слой отбирали в колбы и упаривали на роторном испарителе при 37 °С. Сухой остаток растворяли в 150 мкл подвижной фазы и 50 мкл полученного раствора вводили в хроматограф.

Хроматографирование. Для детектирования использовали спектрофотометрический (УФ) детектор при длине волны поглощения λ=270 нм. Колонка - «Диасорб 130-С16Т», 7 мкм, 250x4 мм («Биохиммак», Россия). Элюент состоял из смеси 0,1 М КН₂РО₄ и ацетонитрила - 83% и 17% по объёму с добавлением о-фосфорной кислоты (рН=3,4). Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. В этих условиях время удерживания тилорона составило 6,5±0,2 мин.

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки. Выявлена линейная зависимость в интервале концентраций 10-250 нг/мл. Коэффициент корреляции составил r²=0,98.

Тинидазол

Реактивы. Субстанция тинидазола, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, метанол для жидкостной хроматографии, натрия гидроксид, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, трихлоруксусная кислота, вода бидистиллированная. Стандартные растворы тинидазола готовили растворением в метаноле и хранили при 4 °С.

Обработка проб. К 200 мкл плазмы крови добавляли 200 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивали на «Vortex»- мешалке 1 мин, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,25 мкм, аликвоту (25-50 мкл) использовали для хроматографирования.

Хроматографирование. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» при длине волны 313 нм и аттенюации 3. Использовали обращён- нофазную хроматографическую колонку «μBondapakTM C18», 10 μm,

3,9×300 мм («Waters», США).

Элюирование проводили мобильной фазой, состоящей из ацетонитрила, метанола и 0,2 М раствора фосфатного буфера (рН=8,0) в объём- ном соотношении 2:1:7. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. Время удерживания тинидазола в данных условиях - 2,7 мин.

Количественное определение тинидазола в плазме крови проводили методом абсолютной калибровки. Калибровку проводили следующим образом. К 1 мл плазмы крови, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора тинидазола, чтобы его концентрация в плазме составляла 0, 1, 5, 10, 20, 30, 40 и 50 мкг/мл. Далее поступали в соответствии с описанной методикой. В указанном диапазоне концентраций калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация тинидазола в плазме крови (мкг/мл); х - площадь хроматографического пика тинидазола.

Коэффициент корреляции r²=0,9954. Предел детектирования тинидазола составлял 0,2 мкг/мл плазмы.

Триметоприм и сульфаметоксазол (ко-тримоксазол)

Реактивы. Субстанции триметоприма, сульфаметоксазола, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, хлороформ, ортофосфорная кислота, серная кислота, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, вода бидистиллированная.

Обработка проб. К 0,5 мл плазмы крови добавляли 50 мкл 0,1 М раствора серной кислоты и 4 мл хлороформа, экстрагировали 10 мин при интенсивном встряхивании в завинчивающихся пробирках. Затем водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин). После чего плазму крови отбрасывали с помощью «ловушки», а органическую фазу количественно переносили в коническую колбу и упаривали досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 150 мкл мобильной фазы, аликвоту (50 мкл) использовали для хроматографирования.

Хроматографический анализ. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» при длине волны 265 нм и аттенюации 3. Использовали обращённофазную хроматографическую колонку «Диасорб 130-С16Т»; 6 μη; 150x4 мм (АО «Биохиммак», Россия).

Элюирование проводили мобильной фазой, состоящей из ацетонитрила и 0,02 М фосфатного буфера (рН=5,0) в объёмном соотно-

шении 1,5:8,5. Скорость элюирования составляла 1,3 мл/мин. Время удерживания триметоприма - 3,1 мин, время удерживания сульфаметоксазола - 10,1 мин.

Количественное определение триметоприма и сульфаметоксазола в плазме крови проводили методом абсолютной калибровки. Для калибровки к 0,5 мл плазмы крови, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора триметоприма (10 и 100 мкг/мл) или сульфаметоксазола (100 и 1000 мкг/мл), чтобы их концентрация в плазме составляла 0, 100, 250, 500, 800, 1000 и 1500 нг/мл триметоприма и 0, 1, 5, 10, 15, 20, 30 и 40 мкг/мл сульфаметоксазола. Далее поступали в соответствии с описанной методикой. В указанном диапазоне концентраций калибровочные зависимости были линейными, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация триметоприма (нг/мл) или сульфаметоксазола (мкг/мл) в плазме крови; a, b - коэффициенты уравнения, соответственно равные 23,8 и 3,3 для триметоприма и 0,6 и 0,01 для сульфаметоксазола; х - площадь хроматографического пика триметоприма или сульфаметоксазола.

Коэффициенты корреляции r² составляли соответственно 0,9986 и 0,9975 для триметоприма и сульфаметоксазола. Пределы детектирования - 50 нг/мл плазмы для триметоприма и 0,5 мкг/мл плазмы для сульфаметоксазола.

Фамотидин

Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Shimadzu» со спектрофотометрическим детектором.

Подготовка проб. К 1 мл сыворотки крови добавляли 100 мкл 1 М NaOH и интенсивно встряхивали на мешалке «Vortex». Затем пробы экстрагировали 5 мл этилацетата. Далее пробы центрифугировали при 4500 об/мин, органический слой отбирали в колбы и упаривали при температуре 37 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл подвижной фазы и 100 мкл инжектировали в хроматограф.

Хроматографирование. Для детектирования использовали УФ-детектор с длиной волны λ=267 нм. Анализировали фамотидин на колонке «Symmetry С18» длиной 250 мм, внутренним диаметром

4,6 мм, зернением 5 мкм. Элюент состоял из смеси 0,03 М К₂НРО₄ и ацетонитрила 86% и 14% по объёму с добавлением о-фосфорной кислоты (рН=3,55). Скорость элюирования составляла 1 мл/мин.

Линейную зависимость наблюдали в диапазоне концентраций 10-350 нг/мл. Предел обнаружения составлял 10 нг/мл.

Фуросемид

Реактивы. Субстанция фуросемида, метанол для жидкостной хроматографии, этилацетат, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, гексансульфоновый натрий, кислота ортофосфорная, вода бидистиллированная. Стандартные растворы фуросемида были приготовлены растворением в метаноле; их хранили при 4 °С.

Обработка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 100 мкл 1 М раствора ортофосфорной кислоты и 5 мл этилацетата, экстракцию проводили в течение 10 мин при интенсивном встряхивании. Затем водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин). Органическую фазу количественно переносили в конические пробирки, содержащие по 200 мкл фосфатного буферного раствора (рН=7,6). Реэкстрацию проводили на «Vortex»-мешалке в течение 1 мин, затем после краткого центрифугирования аликвоту (100 мкл) водного слоя наносили на колонку хроматографа.

Хроматографирование. Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» и аттенюацией 3 при длине волны 276 нм. Использовали хроматографическую колонку «Диасорб 130-С16Т» 150x4 мм («Биохиммак», Россия) с размером частиц 6 мкм.

Мобильную фазу, состоящую из смеси метанола и фосфатного буферного раствора (рН=3) в объёмном соотношении 3:7, подавали со скорость 1 мл/мин. Время удерживания фуросемида в данных условиях составило 9,9 мин.

Количественное определение фуросемида проводили методом абсолютной калибровки. Для калибровки к 1 мл плазмы, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора фуросемида (10 мкг/мл), чтобы его концентрация в плазме составляла 0, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 и 1500 нг/мл. В указанном диапазоне концентрации калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация фуросемида в плазме крови (нг/мл); х - площадь хроматографического пика фуросемида.

Коэффициент корреляции r²=0,9978. Предел детектирования фуросемида - 20 нг/мл плазмы.

Ципрофлоксацин

Реактивы. Субстанция ципрофлоксацина, хлороформ для жидкостной хроматографии, ацетонитрил для жидкостной хроматографии, метанол, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, гексансульфоновая кислота, ортофосфорная кислота, водный раствор аммиака 25%, вода бидистиллированная.

Обработка проб. К 1 мл плазмы крови добавляли 0,5 мл фосфатного буфера (рН=7,0) и 7 мл хлороформа, экстрагировали 10 мин при интенсивном встряхивании в завинчивающихся пробирках. Затем водный и органический слои разделяли центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин). После чего плазму крови отбрасывали с помощью «ловушки», а органическую фазу количественно переносили в пробирку, содержащую 200 мкл 1% водного раствора аммиака, перемешивали на «"V5rtex»-мешалке 1 мин и после краткого центрифугирования (2 мин) аликвоту (50-100 мкл) водной фазы использовали для хроматографирования.

Хроматографический анализ. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Hewlett-Packard» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны «Series 1050» при длине волны 270 нм. Использовали обращённофаз- ную хроматографическую колонку «Zorbax ODS С18» (150×4,6 мм) с размером частиц 5 мкм.

Элюирование проводили мобильной фазой, состоящей из 650 мл воды, 1,74 г натрия дигидрофосфата, 20 мг гексансульфоновой кислоты, 350 мл метанола, которую подкисляли до рН=3,0 ортофосфорной кислотой. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. Время удерживания ципрофлоксацина - 3,5 мин.

Количественное определение ципрофлоксацина в плазме крови проводили методом абсолютной калибровки. К 1 мл плазмы крови, не содержащей препарата, добавляли такие количества стандартного раствора ципрофлоксацина, чтобы его концентрация в плазме

составляла 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 и 5 мкг/мл. Затем поступали в соответствии с описанной методикой. В указанном диапазоне концентраций калибровочная зависимость была линейной, уравнение регрессии имело вид:

где y - концентрация ципрофлоксацина в плазме крови (нг/мл); х - площадь хроматографического пика ципрофлоксацина.

Коэффициент корреляции r²=0,996. Предел детектирования ципрофлоксацина - 50 нг/мл плазмы.