ГЛАВА 10 ФОРМЫ ГИБЕЛИ КЛЕТКИ

Общие данные

Формы гибели клетки определяются характером и степенью ее повреждения. Они зависят от типа клетки, энергетического статуса (уровень АТР) и иммунного статуса (активность Т-киллеров).

Известны следующие основные формы гибели клетки или прекращения ее биологической активности с последующим фагоцитозом остатков - это апоптоз (программированная гибель), некроз (гибель при повреждении) и смешанные формы.

В частности, при необратимой гибели клеток почечной ткани, индуцированной токсинами или острой почечной недостаточностью, некроз может включать элементы апоптоза.

В ацинарных клетках поджелудочной железы наблюдается форма апонекроза (некрозоподобный фенотип).

В исследованиях in vitro на культуре клеток 293Т выделена форма параапоптоза, неапоптотического типа программированной гибели с частично апоптозной морфологией, набуханием митохондрий, но без фрагментации ядра клетки.

Кроме того, высказано предположение о существовании апоптозонекрозного континуума, определяемого перекрестным взаимодействием процессов гибели клетки и процессов сохранения гомеостаза (cross-talk).

Все указанные формы гибели клетки отличаются по своим морфологическим, молекулярно-биохимическим и клиническим критериям.

Морфологические критерии апоптоза и некроза

Морфологические критерии апоптоза и некроза приведены на рис. 47.

Для апоптоза характерны: конденсация хроматина, целостность плазматической и внутриклеточных мембран, набухание митохондриальных мембран.

При апоптозе клеточное содержимое не попадает в межклеточное пространство и не вызывает воспалительной реакции, так как остатки клетки фагоцитируются макрофагами или соседними клетками.

Рис. 47. Морфологические изменения клетки при апоптозе и некрозе (по Самуилову В.Ф., 2001):

1 - нормальная клетка; 2 - апоптическое сморщивание с образованием пузырчатых выростов; 3 - фрагментация мембраны с образованием апоптотических телец; 4 - набухание и некротическая дезинтеграция клетки

Для некроза характерны: набухание всей клетки и всех ее органелл, разрыв плазматической и внутриклеточных мембран, активация лизосомных ферментов и воспалительная реакция (в результате попадания внутриклеточного содержимого во внеклеточную среду).

ХАРАКТЕРИСТИКА АПОПТОЗА

В здоровом организме процесс апоптоза сбалансирован процессом физиологической регенерации клетки. Апоптоз - это генетически контролируемый молекулярный (биохимический) механизм, ответственный за поддержание постоянной численности нормальных клеток, выбраковку и удаление дефектных клеток и, следовательно, выживание, старение и смерть клеток и тканей организма. Как правило, апоптоз - это результат опосредованного (через рецепторные системы клетки) неспецифического или нефизиологического действия внешних факторов, выступающих как индукторы, способные при интенсивном воздействии вызвать гибель клетки. Вместе с тем, апоптоз связан с внеклеточными и внутриклеточными сигналами, выступающими в роли мощных физиологических факторов.

Прежде всего, к таким факторам относятся гормоны (например, половые гормоны), которые либо индуцируют, либо ингибируют гибель клетки в зависимости от стадии ее дифференцировки (см. главы 9 и 14).

Другими физиологическими факторами являются цитокины или продуцируемые клетками сигнальные (полифункциональные) пептиды, связывающие специфические рецепторы на клетках-мишенях. В зависимости от функции цитокины делятся на факторы роста, факторы семейства TNF, интерлейкины и интерфероны (см. главу 8). Действие цитокинов на клетки неоднозначно (так же как у гормонов): для одних клеток они являются индукторами, для других - ингибиторами апоптоза, что связано с типом клетки, стадией дифференцировки, функциональным состоянием. Следовательно, программированная гибель клетки зависит от соотношения специфических и неспецифических регуляторов (физиологических и нефизиологических).

Молекулярно-биохимические критерии апоптоза

К молекулярно-биохимическим критериям апоптоза относятся:

•  энергозависимость; определяется самой клеткой благодаря наличию АТР (соотношение в клетке АТР/АДР);

•  расщепление ядерной ДНК на фрагменты, кратные 180-200 н.п., что приводит к формированию на электрофореграмме ДНКовой лестницы;

•  уменьшение объема клетки; клетка сморщивается в течение нескольких минут, теряя до 1/3 своего объема;

•  активация цистеиновых протеаз (каспаз), вызывающих деградацию белков;

•  экстернализация или появление ФС на наружной поверхности плазматической мембраны; связана с формированием из мембраны апоптотических телец (фрагментов), способствующих их узнаванию макрофагами и последующему фагоцитозу.

Фазы апоптоза

Выделены четыре фазы апоптоза: инициация апоптотического сигнала (первая), трансдукция или проведение апоптотического сигнала (вторая), активация каспаз (третья), деградация ДНК (четвертая).

Инициация, трансдукция и проведение апоптотического сигнала

В зависимости от характера стимула, инициирующего апоптоз, выделяют два сигнальных каскада (пути): рецепторный и митохондриальный.

Рецепторный путь опосредован специфическими «рецепторами смерти», расположенными на плазматической мембране - это факторы TNF .

Наиболее изучен рецептор Fas (Fas-R), или CD95. Его цитоплазматический домен обогащен цистеином, а интегральная (мембранная) часть содержит «домен смерти», или DD, вовлекаемый в белокбелковое взаимодействие с генерацией «сигнала смерти». Лиганд этого рецептора (Fas-L) относится к цитокинам - пептидам из семейства TNF; он экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и естественных киллерах. Связывание лиганда Fas-L с рецептором Fas-R приводит к олигомеризации последнего и формированию сигнального комплекса, инициирующего каскад реакций апоптоза.

В олигомеризации Fas-R участвуют: цитоплазматический DD-домен рецептора, адапторный пептид FADD (Fas- ассоциированный DD, содержащий DED-эффекторный «домен смерти») и прокаспазы-8. Образование этих белков активируют каспазы-8 (см. ниже), что вызывает каскад апоптотических реакций.

В последние годы установлено, что мутации в генах Fas и Fas-L обусловливают развитие ряда аутоиммунных заболеваний, а в случае появления опухолевых клеток активность каспазы-8 может ингибироваться специфическим белком FLIP, препятствующим апоптозу.

Также описан апоптоз, инициированный связыванием рецепторов семейства TNF, содержащих домены DD (TNF-R), с лигандом TRAIL. Их олигомеризация аналогична Fas-R / Fas-L и осуществляется с участием FADD и сходного с ним пептида TRADD (TNF- R-ассоциированный DD). Все указанные примеры характеризуют рецепторный путь апоптоза.

Активация каспаз

Каспазы - это специфические цистеиновые протеазы, катализирующие расщепление белков. Они считаются ключевыми ферментами апоптоза, расщепляющими пептидную связь по карбоксильному концу остатка аспарагиновой кислоты, что ведет к активации или инактивации белка. Мишенями для каспаз служат белки, деградация которых вызывает развитие характерных для апоптоза необратимых процессов - это мембранные белки, белки ядра и цитоплазмы клетки.

Выделено 14 типов каспаз, синтезируемых в виде зимогенов или прокаспаз (имеют большой молекулярный вес), которые затем активируются путем протеолитического процессинга.

В зависимости от функции семейство каспаз делится на 2 подсемейства.

•  Первое подсемейство - это каспазы-1, -4 и -5, участвующие в созревании цитокинов. Сюда также относятся интерлейкин-1 бета и интерлейкин-18, усиливающие противовоспалительные свойства цитокинов.

•  Второе подсемейство - это каспазы, участвующие в ферментативном каскаде реакций апоптоза. Среди них выделяют эффекторы (гидролизуют структурные белки) и индукторы (принимают и передают апоптотические сигналы).

В неповрежденной клетке активность каспаз регулируется путем:

•  взаимодействия индуктора апоптоза со специфическими рецепторами, например, активация каспазы-8 в Fas/Fas-L системе;

•  образования гетеродимеров каспаз со специфическими регуляторными белками семейства Вс1-2 (см. ниже);

•  взаимодействия каспаз с сериновой протеазой или гранзимом В (GrB) при воздействии цитотоксических Т-лимфоцитов.

Высказаны предположения, что действие каспаз на белки цитоскелета клетки приводит к изменению ее формы и что ингибиторы каспаз не полностью блокируют сморщивание клетки.

В апоптозе может участвовать цитозольная фосфолипаза, которая служит субстратом для каспаз 2 и 8 (см. главы 6 и 10). Возможно, что инактивация цитозольной фосфолипазы ведет к снижению синтеза противовоспалительных простагландинов, образующихся из арахидоновой кислоты, которая является продуктом гидролиза фосфолипидов.

Для TNF-индуцированного апоптоза также показана активация каспазой-3 цитозольной фосфолипазы.

Участие фосфолипаз, вероятно, усиливает повреждение лизосом, что связано с наличием «лизосомо-митохондриальной оси» апоптоза, определяющей эффекты каспаз, лизосомных гидролаз и генерацию митохондриями АФК. На рис. 48 показаны некоторые пути передачи апоптозного сигнала в клетке, включая митохондриальный путь, при котором действие индукторов апоптоза ведет к резкому снижению величины электрохимического потенциала митохондрий и сопровождается выходом в цитоплазму цитохрома-с, который инициирует активацию каспаз.

Наряду с выходом в цитоплазму цитохрома-с возможно высвобождение митохондриями других медиаторов: прокаспаз-2, -3 и -9, AIF, эндонуклеазы G, что, по-видимому, контролируется белками

Рис. 48. Некоторые пути передачи апоптозного сигнала в клетке (по Скулачеву В.П., 2001)

семейства Вс 1-2 (см. выше), которые кодируются одноименными генами и относятся к наиболее известным внутриклеточным регуляторам апоптоза (для них характерны гомологичные домены или домены ВН 1-4).

В зависимости от функции среди этих регуляторов апоптоза выделяют: антиапоптотические белки (Вс1-2, Вс1-3, Вс1-х, Мс1-1) с доменами ВН 1, 2, 4 и проапоптотические белки (Bid, Bad, Bax, Bim) c доменом BH 3. Например, белок Bid (tBid) взаимодействует с митохондриальными липидами, индуцируя высвобождение эндонуклеазы G и внедрение лизофосфолипидов (особенно лизоФХ) в мембрану митохондрий с последующим ее разрывом. В этом случае эффект разрыва мембраны, вероятно, связан с «заякореванием» С-концевых доменов проапоптотических белков Вс1-2, что способствует их воздействию на мембраны эндоплазматического ретикулума и митохондрий с возможным формированием в них гигантских транзитных пор (РТР) или мегаканалов.

Считается, что соотношение белков этого семейства определяет предрасположенность или устойчивость клеток к апоптозу. Важной общей чертой для митохондриального и рецепторного путей апоптоза

является деполяризация (дезинтеграция) митохондрий, сопровождающаяся глубокими изменениями проницаемости их мембран с последующим образованием мегаканалов. Одним из них служит неспецифический канал, образующийся при окислении SH-группы Cys-56 в аденин-нуклеотидтранслоказе - это белок внутренней мембраны митохондрий, осуществляющий антипорт АТФ/ΑΌΦ (см. главу 6). Этот мегаканал (РТР-комплекс) содержит множество мишеней для внешнего воздействия и регулируется такими эндогенными факторами, как АФК и оксид азота, либо изменениями электрохимического потенциала митохондрий и концентрации ионов Са²+ и Mg²+, а также изменениями соотношений АТФ и ΑΌΦ, липидов и белков, белков Вс 1-2 и др.

Считается, что гигантская пора интегрирует ответные реакции клетки на стрессовое воздействие, и ее раскрытие происходит практически при всех процессах клеточной гибели, что изменяет проницаемость митохондрий.

Деградация ДНК

Если начальные стадии апоптоза различаются в зависимости от типа клеток и индуцирующих сигналов, то фаза деградации ДНК универсальна для большинства клеток. Это необратимая терминальная стадия апоптоза, контролируемая белками семейства Вс1-2.

К хорошо изученным ядерным белкам-регуляторам апоптоза относится белок р53 (мол. масса 53 кДа) или фактор транскрипции, запускающий апоптоз и блокирующий процесс деления клетки с поврежденной ДНК - это первая особенность апоптоза. Так, на ранних стадиях повреждения ДНК экспрессия фактора р53 повышается, что блокирует клеточный цикл в фазах G₁ и G₂ (см. главу 9) и предоставляет клетке возможность репарировать поврежденную ДНК фосфолипазой PLA₂, предотвращая тем самым появление мутаций.

Если активность клеточных систем репарации недостаточная (см. главу 11) и повреждения в ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется апоптоз.

Накопление в клетке фактора р53 возможно при обоих путях апоптоза.

Вместе с тем, почти у 50% типов изученных опухолевых клеток ген р53 был инактивирован, и связанная с ним регуляция клеточного гомеостаза была нарушена, что приводило к накоплению дефектных клеток.

Вторая особенность апоптоза - это концентрация в цитоплазме свободного ионизированного кальция. Повышение его уровня способствует запуску апоптозного митохондриального каскада сигналов, инициирующего образование транзитных пор и выход в цитоплазму цитохрома-с и эндонуклеазы G.

В освобождении кальция из клеточных депо принимают участие вторичные мессенджеры: диглицерид и инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3), генерация которых в клетке связана с активацией разных изоформ фосфолипазы С (см. выше).

С нарушением нормального гомеостаза кальция связана инициация апоптоза некоторыми токсинами. Однако для этого необходимо сохранение основного пула АТР, иначе клетка может перейти к другому механизму гибели - некрозу (см. ниже).

Роль фосфолипидов и других соединений в апоптозе

Завершение апоптоза - это фаза фрагментации погибшей клетки на «апоптотические тельца«. В этой фазе наиболее существенные процессы протекают в плазматической мембране, где происходит перераспределение фосфолипидов, а во внешнем монослое мембраны наблюдается экстернализация ФС, его присоединение к ней (транслокация) и последующее окисление (см. главу 6).

Транслокация ФС осуществляется с участием Са²+- активированной скрамблазы и КЛ митохондрий (в случае свободнорадикального окисления). Эта скрамблаза - сигнал к поглощению «рецептора внешнего ФС», который экспрессируется в разных клетках и тканях, и благодаря этому «апоптотические тельца» захватываются и перевариваются не только фагоцитами, но и соседними клетками. При этом рецепторы к ФС оказывают противовоспалительное действие, подавляя иммунную реакцию фагоцитирующей клетки. Кроме того, в апоптотической клетке возрастает генерация лизоФХ, который служит хемотаксическим фактором - источником сигнала «seak me», стимулирующего приток фагоцитов к данной области.

В апоптоз вовлечены в качестве сигнальных вторичных мессенджеров такие производные фосфолипидов, как церамиды, сфингозин и SIP, способные к регуляции как процессов выживания, так и гибели клетки.

Например, церамид регулирует ключевые факторы апоптоза: полярное перераспределение и олигомеризацию рецептора Fas с формированием суперкаталитического домена, дестабилизацию митохондриальных мембран (путем участия Вах-индуцированных неспецифических

церамидных пор и повышения проницаемости мембран), а также высвобождает апоптогенные факторы, например, цитохром-с. В свою очередь, сфингозин (производное церамида) усиливает апоптоз под действием церамидаз, ингибируя протеинкиназу С (см. главу 6).

Из церамида же образуется SIP или сигнальный липид, обладающий антиапоптотическими свойствами. Его эффекты реализуются с помощью четырех механизмов:

•  активации антиапоптотических сигнальных путей (NFkB, ERK- киназа);

•  снижения в лимфоцитах экспрессии проаптотических белков Вс1-2 (Вах), блокирующих апоптоз (см. выше);

•  антиапоптотического действия по предотвращению процессов, индуцированных стрессом в митохондриях (блокирование выхода цитохрома-с и активации каспаз);

•  блокирования апоптоза в эндотелиальных клетках путем повышения уровня оксида азота.

В последние годы была также продемонстрирована специфическая роль в апоптозе мембранных рафтов, что связано с регуляцией ионных каналов и сборкой сигнальных комплексов (см. главу 8). При этом индукторы апоптоза вызывали реорганизацию рафтов и их укрупнение в большие «мембранные платформы», обогащенные церамидами.

Завершая рассмотрение механизмов апоптоза, следует отметить, что повреждение клеточной мембраны не является его первопричиной, хотя и служит важной составляющей механизма апоптоза (здесь происходят олигомеризация и наружная ориентация апоптозных рецепторов и локализуются многие апоптотические сигналы, включая экстернализацию ФС).

ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКРОЗА

Некроз - это форма пассивной гибели клетки под действием внешних факторов, на которые клетка не может или не успевает отреагировать с помощью собственных защитных систем. В результате происходит нарушение клеточных функций (в первую очередь повреждаются клеточные мембраны).

В зависимости от своей природы факторы, вызывающие некроз, делятся на физические, химические и биологические (биогенные). Устойчивых к ним клеток в живой природе нет.

Молекулярно-биохимические механизмы некроза

Биохимические механизмы некротической гибели приведены на рис. 49.

В этих механизмах ключевую роль играют три сопряженных процесса:

•  резкое повышение концентрации в цитозоле ионов Са²+;

•  разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях с истощением запасов клеточного АТФ;

•  увеличение проницаемости плазматической мембраны и ее повреждение.

Все сопряженные процессы относятся к деструктивным. Они протекают одновременно и взаимосвязанно, и каждый процесс усиливается генерацией АФК и нарастающим окислительным стрессом. Вместе с тем процесс увеличения проницаемости плазматической мембраны и ее повреждение - это еще обратимый этап некроза. Поэтому важной основой для эффективного терапевтического воздействия на погибающие в ходе некроза клетки является направленное торможение или блокирование всех трех сопряженных процессов, если оно сочетается с репарацией поврежденных мембран.

Рис. 49. Биохимические процессы при некротическом повреждении клетки (по Bhatia M., 2004)

Механизмы некроза зависят от характера патогенного воздействия, структурных и функциональных особенностей поврежденной ткани, а также конституциональных особенностей организма.

Типы некроза

В зависимости от механизмов развития различают два типа некроза: первый тип - это прямое или непосредственное травматическое (токсическое) воздействие; второй тип - это непрямое или опосредованное воздействие через нейроэндокринную или сердечнососудистую системы организма. Например, при первом типе некроза происходит резкое энергетическое «истощение» клеток: разобщаются митохондриальные процессы окислительного фосфорилирования, существенно снижается синтез АТР, нарушается работа АТР-зависимых ионных каналов, утрачивается регуляция ионного гомеостаза и разрушаются белки цитоскелета клетки. При этом плазматическая мембрана теряет способность регулировать клеточный объем и ионную проницаемость. В результате усиливается транспорт ионов, нарушается осмотическое равновесие, увеличивается концентрация ионов Na+ в цитозоле.

В свою очередь, реакции резкого истощения активируют Na+-, К⁺-АТРазу, что еще больше истощает запасы АТФ, способствуя набуханию митохондрий и развитию отека клетки.

В самом начале повреждения ионный гомеостаз еще поддерживается одновременным оттоком ионов К⁺, однако в дальнейшем ионные насосы блокируются, и приток в клетки ионов Na⁺ и воды увеличивается.

В последние годы на различных клеточных культурах была показана роль некоторых ионных насосов и трансмембранных каналов в развитии некротического процесса. Среди них: Na+ / К+-насос; Na+/ Н+- и Na+/ Са²+-ионные каналы; Na+-, K+-, 2С1^--котранспортер.

Например, неспособность клеточных мембран поддерживать низкую концентрацию Са²⁺ в цитоплазме и регулировать гомеостаз митохондриального Са²⁺ лежит в основе необратимости молекулярнобиохимических нарушений при ишемии мозга и миокарда, ряде аутоиммунных заболеваний и других болезней, а также при цитотоксическом воздействии многих химических соединений, включая лекарства.

Высокие концентрации Са²⁺ в цитоплазме в условиях окислительного стресса раскрывают в митохондриях транзитные поры (как при

апоптозе), что снижает митохондриальный трансмембранный потенциал, приводит к деградации ?+,К+-АТРазы и еще больше усиливает повреждение мембраны.

Наряду со снижением мембранного потенциала нарушается осмотический баланс между матриксом и межмембранным пространством митохондрий, после чего в матрикс поступает вода, вызывая его набухание и разрыв наружной мембраны. В результате в поврежденных митохондриях резко снижается генерация АТР и наступает некроз клетки.

Раскрытие пор и увеличение проницаемости митохондриальных мембран контролируют специфические вторичные месседжеры (и проаптотические белки семейства Вс1-2 - см. выше), что характерно для атеросклероза, сахарного диабета, нейродегенеративных заболеваний, процессов старения и цитолитического гепатита.

РАЗЛИЧИЯ И ОБЩНОСТЬ АПОПТОЗА И НЕКРОЗА

Некроз отличается от апоптоза следующим. При некрозе:

•  наблюдается аутолиз клетки, и ее содержимое изливается в межклеточное пространство, где развивается процесс воспаления;

•  отсутствует зависимость от энергетического статуса клетки;

•  отсутствует генетический контроль с помощью специфических белков-регуляторов;

•  в процесс одновременно вовлечена большая группа соседних клеток и тканей, подвергшихся общему интенсивному воздействию повреждающих факторов;

•  структурно-функциональные изменения в клетке подчинены сопряженным друг с другом общим молекулярно-биохимическим закономерностям, первопричиной которых служит нарушение ионного гомеостаза.

Несмотря на разную природу повреждающих факторов, при некрозе выделен ряд общих с апоптозом биохимических каскадов. Среди них:

•  нарушение окислительного фосфорилирования (синтеза АТР) и гликолиза;

•  нарушение внутриклеточного баланса Са²⁺ (его накопление);

•  увеличение проницаемости плазматической мембраны и мембран внутриклеточных органелл;

•  генерация АФК и свободных радикалов;

•  необратимое разрушение митохондрий;

•  повреждение ядра клетки с активацией эндонуклеаз и деполимеризацией (дезинтеграцией) ДНК и РНК.

Рассмотрим на примере разрушения митохондрий значение некоторых из этих каскадов биохимических реакций. Именно степень разрушения митохондрий определяет возможность выживания клетки и путь ее гибели (апоптоз или некроз).

Известно, что митохондрии нормальной клетки служат источником АФК, допустимый уровень которых поддерживается защитной ферментной системой, включающей цитохромоксидазу, супероксиддисмутазу, глутатионпероксидазу (см. главу 11).

В поврежденной клетке концентрация АФК нарастает, что ведет к открытию транзитных пор с выходом в цитоплазму цитохрома-с и АФК, что сдерживает их дальнейшую генерацию.

Если транзитные поры остаются открытыми (и при этом сохраняется избыток АФК), то наступает гибель митохондрий или так называемый митоптоз, ведущий либо к апоптозу (за счет цитохрома-с и AIF), либо к некрозу (при нехватке АТР).

Клинические проявления некроза отличаются выраженным полиморфизмом, в основе которого лежат «местная смерть» группы соседних клеток и выключение из функционирования жизненно важных клеточных зон. Таковы, например, причины инфарктов миокарда, ишемии головного мозга, некрозов коркового вещества почек, прогрессирующего некроза печени и острого панкреатита, осложненного панкреонекрозом.

Следовательно, некроз, являясь результатом непрограммированных, но биохимически, морфологически и клинически максимально выраженных деструктивных процессов в клетке, вносит существенный вклад в патогенез многих заболеваний.

Обратимость и необратимость повреждений при некрозе

Повреждение митохондрий при некрозе может быть обратимым в случае нерезко выраженного радиационного воздействия (включая УФО). При этом обратимым считается само явление формирования транзитных пор.

Возможна обратимость повреждений целых клеток, но только на начальных этапах.

Обратимая стадия - это, во-первых, неспецифическая реакция в ответ на любое раздражение клетки. Для нее характерны:

•  увеличение проницаемости мембран для ионов Са²⁺ и последующая активизация гидролаз с развитием метаболических нарушений;

•  изменение состава липидов и микровязкости фосфолипидного бислоя мембран;

•  возрастание доли холестерина при атеросклерозе и старении;

•  частично компенсируемые процессы ПОЛ при сахарном диабете (см. главу 9).

Во-вторых, обратимость повреждений наблюдается при ишемии миокарда с последующей реперфузией. Всего два фактора обусловливают необратимость повреждений при ишемии - это дисфункция митохондрий клетки с резким дефицитом АТФ и дисфункция клеточных мембран.

Вместе с тем, в настоящее время не определены критерии перехода поврежденной клетки из обратимого состояния к необратимому.