ГЛАВА 8. ПРИНЦИПЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ИММУНОКОМПРОМЕТИРОВАННЫХ ЛИЦ

Принципы выявления иммунокомпрометированных лиц основываются на анамнезе, результатах клинико-лабораторного и иммунологического обследований и проводятся с целью прогноза развития у больного иммунопатологических состояний, а также выбора метода лечения, контроля его эффективности и разработки противорецидивной терапии. Для этого выполняется оценка иммунного статуса, интерпретация данных иммунограмм, учет клинических проявлений иммунных нарушений и др.

8.1. ПРИНЦИПЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА

Иммунный статус определяется количеством и активностью лимфоидных и фагоцитарных клеток, находящихся в циркуляции, состоянием системы комплемента, факторов неспецифической резистентности, киллерными клетками, иммуноглобулинами, специфическими АТ, ИЛ и другими показателями.

Все параметры иммунного статуса можно разделить на: 1) неспецифические, отражающие общие изменения иммунной системы; 2) связанные с данной патологией опосредованно; 3) специфические, устанавливающие конкретные иммунные механизмы заболеваний.

Неспецифические показатели. Наиболее широко распространенные методы оценки иммунного статуса связаны с лимфоцитами. Для их выделения разработаны различные методические приемы.

Создаются градиенты плотности сред, задерживающие именно эти клетки за счет их плотности: фиколл-верографин, фиколл-гипак, плазма-перколл и др. В ряде случаев от эритроцитов освобождаются с помощью различных лизирующих растворов.

Оценка состояния трех основных звеньев иммунитета Т-, В- и фагоцитарного разделяется на количественную и функциональную.

Количественное тестирование популяций и субпопуляций лимфоцитов основано на характеристике специфических для каждого вида клеток рецепторов, по их способности связываться с Аг либо с клетками. Так, CD3 (Т)-лимфоциты, например, несут рецепторы к эритроцитам барана и образуют с ними так называемые Е-РОК. Подсчитав процент таких клеток и переведя его в абсолютные значения, можно определить содержание CD3 (Т)-лимфоцитов. CD19 (В)-клетки обра-

Рис. 7. Методы количественной оценки Т- и В-клеток (Б.Н. Райскис и соавт.)

зуют розетки либо с эритроцитами мышей, либо с эритроцитами быка, нагруженными АТ против них и комплементом - ЕАС-РОК.

Более чувствительной является идентификация клеток с помощью моноклональных АТ против маркерных Аг популяций и субпопуляций лимфоцитов. Исследуемые лимфоциты обрабатывают моноклональными АТ (анти-CD), затем либо диагностикумами, нагруженными АТ против «первых» АТ, либо АТ и их Fab-фрагментами (против «первых» АТ), меченными флуорохромами, дающими специфическое свечение в люминесцентном микроскопе. Созданы лазерные сортеры (проточные цитофлуориметры) для выявления субпопуляций лимфоцитов, меченных таким образом моноклональными АТ.

Для оценки функциональной активности клеточного звена иммунитета используют 4 группы методов.

1. Постановка кожных проб ГЗТ.

2. Стимуляция лимфоцитов in vitro в РБТЛ.

3. Функциональная оценка CD4-лимфоцитов.

4. Функциональная оценка CD8-клеток (киллерных клеток и т.д.).

Рис. 8. Методы оценки функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета (Б.Н. Райскис и соавт.)

Для постановки кожных проб используется: очищенный туберкулин (реакция Пирке), паротитный, стрептококковый, столбнячный, дифтерийный Аг, трихофитин, кандидин, стрептокиназа, динитрохлорбензол и др.

Стимуляция лимфоцитов в РБТЛ основана на способности лимфоцитов при определенных условиях превращаться, в увеличенные бластоподобные клетки, активно синтезирующие ДНК.

Для характеристики функции CD4-лимфоцитов мононуклеарные клетки крови инкубируют с поликлональным активатором лимфоцитов митогеном лаконоса и количественно измеряют индуцированную им продукцию иммуноглобулинов. Далее в систему вносят клетки с предполагаемой хелперной способностью и определяют прирост образования иммуноглобулинов.

Для оценки функции CD8-лимфоцитов воспроизводится описанная выше методика, но добавляют в культуру клетки с супрессорной активностью, регистрируя снижение суммарных иммуноглобулинов.

Одним из методов определения функциональной активности CD19- лимфоцитов является оценка синтеза иммуноглобулинов в культуре этих клеток, а также выявление в сыворотке крови, слюне, кишечном содержимом количества иммунных глобулинов основных классов. Для этого используется метод двумерной диффузии в агаровом геле, разработанный Манчини (в лунки агарового геля, содержащего АТ к различным классам иммуноглобулинов, добавляют искомые сыворотки, содержащие Ig, образуются кольца преципитации, размер которых по номограммам позволяет определить концентрацию Ig разных классов).

Дополнительным показателем в оценке гуморального иммунитета является определение концентрации естественных АТ, например, изогемагглютининов (титр в норме 1:16 - 1:64), уровень АТ к кишечной палочке, Аг коклюшного возбудителя, дифтерии, столбняка, поскольку подавляющее большинство людей иммунизировано данными Аг в плановом порядке, т.е. АТ против указанных Аг должны быть у всех.

Для измерения функции системы фагоцитоза изучается микробоцидная способность, фагоцитарная активность, подвижность моноцитов и гранулярных лейкоцитов (гранулоцитов). Метаболическая способность определяется косвенным путем в тесте восстановления нитросинего тетразолия, используя спонтанную и индуцированную реакции.

Кислородный метаболизм фагоцитов также изучают методом хемилюминесценции, который обусловлен генерацией Н₂О₂ и супероксидного радикала и прямо коррелирует с киллерной способностью клетки. Применяющиеся методы позволяют определить непосредственно кислородный метаболизм, образование различных активных кислородных радикалов индивидуальными клетками. Последний анализ может выполняться на проточном цитофлуориметре.

Поглотительные возможности определяют в реакции фагоцитоза указанных клеток каких-либо объектов: бактерий, дрожжевых клеток, частиц латекса, зимозана и т.д. Подсчитывается процент фагоцитирующмх лейкоцитов и фагоцитарный индекс, т.е. среднее число поглощенных одним фагоцитом частиц при подсчете 100 клеток.

Для оценки функциональных резервов фагоцитирующих клеток использовали фагоцитарную реакцию с определением фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа. Для определения переваривающей способности клеток реакцию учитывали через 30 мин и через 2 ч. В качестве стимулятора in vitro использовали продигиозан.

Киллерная способность фагоцитов может быть определена непосредственно по киллингу живых дрожжей, который оценивается с помощью красителя акридинового оранжевого, применяются и специальные красители, позволяющие определить киллинг бактерий отдельными фагоцитами на проточном цитофлуориметре.

Подвижность фагоцитов, в частности, нейтрофильных гранулоцитов или моноцитов периферической крови, измеряется либо по величине спонтанной миграции из капилляров за определенный промежуток времени, либо по измерению этой реакции в присутствии веществ, обладающих хемотаксическим действием.

Анализируются также адгезия на поверхность или их агрегация, четко отражающие функциональную активность клеток, в том числе обусловливаемую молекулами адгезии.

Определение рецепторов на нейтрофилах или моноцитах также проводится для оценки функциональной активности фагоцитарной системы.

Оценка системы комплемента производится в гемолитической системе, состоящей из эритроцитов барана со специфической антисывороткой к ним. Сыворотку предварительно прогревают при 56⁰С в течение 30 мин для разрушения собственного комплемента, а затем добавляют ее в исследуемую сыворотку как источник АТ. Рассчитывается 50% гемолиз, содержание комплемента выражают в единицах СН₅₀ (единица активности, за которую принимают количество комплемента, вызывающее 50% лизис определенного количества сенсибилизированных специфическими АТ эритроцитов).

Количественное определение компонентов комплемента и ингибиторов проводится иммунохимическим методом с использованием моноспецифических анти-сывороток по методу Манчини или в системе, где отсутствует определенный компонент системы комплемента, а остальные ее компоненты присутствуют в избытке.

Активность киллерных клеток измеряется в пробах с мишенями, меченными радиоактивными изотопами, которые выделяются в культурную среду после разрушения клеток киллером.

Специфические методы оценки иммунного статуса (рис. 9).

Таблица 7. Сравнительная характеристика чувствительности методов выявления антител (по Р. Петрову, 1982)

Рис. 9. Специфические методы оценки иммунного статуса

К ним относят иммунофлуоресценцию - использование АТ, меченных иммунофлуоресцирующим красителем, например, флуоресцеином изотиоцианатом, родамином и др. С их помощью обнаруживают места локализации Аг. В ультрафиолетовом свете они хорошо видны.

При радиоиммунном методе используют меченные радионуклидами I¹³¹ или I¹²⁵ (радиоизотопы йода) АТ или Аг. Применяют стандартное количество антисыворотки, связывающей 70-80% меченого Аг. Затем в реагирующую систему вносят искомый немеченый Аг. Он конкурирует с меченым за АТ. Суммарная радиоактивность реагирующей системы падает. Чем больше немеченого Аг в системе, тем в большей степени снижается ее радиоактивность, которую можно измерить, и по полученным данным определить содержание искомого (немеченого) Аг в исследуемой смеси.

Иммуноферментный анализ (ИФА) чувствителен и достаточно прост. Реакцию обычно ставят в пластиковых планшетах, к стенкам их лунок фиксируют АТ к Аг, который следует обнаружить в материале; в другой модификации можно использовать маркерный Аг. Далее вносится исследуемый субстрат, содержащий искомый Аг. Он соединяется с АТ, образуя комплекс Аг-АТ. Не прореагировавший исследуе-

мый субстрат удаляют и вместо него вносят АТ, меченные каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Они присоединяются к комплексу Аг-АТ, адсорбированному на полистироле лунки. Далее в систему вносят вещество, дающее цветную реакцию в присутствии пероксидазы хрена. По интенсивности окрашивания количественно оценивается реакция.

8.2. ПРИНЦИПЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ЛЮДЕЙ С РАССТРОЙСТВАМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

Разработаны двух- и трехуровневый методы иммунного мониторинга (Р.В. Петров и др.).

Двухуровневое иммунное обследование. На первом уровне выявляют грубые дефекты клеточного и гуморального иммунитета, а также фагоцитарного звена. К ним относят: определение относительного и абсолютного количества лимфоцитов и абсолютного количества лейкоцитов, содержание Е-РОК (CD3 (Т)-лимфоцитов) и ЕАС-РОК (CD19 (В)-лимфоцитов); уровень сывороточных IgG, IgА, IgM; оценку фагоцитарной активности лейкоцитов.

На втором уровне исследуют более сложные и информативные показатели: количество CD4-лимфоцитов и CD8-клеток; спонтанную миграцию и торможение миграции лейкоцитов в присутствии ФГА; супрессорную активность CD3 (Т)-лимфоцитов в пробе с КонА; выраженность (при отсутствии противопоказаний) кожных реакций (ГЗТ) на туберкулин, грибковые антигены, динитрохлорбензол и другие аллергены; пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов в РБТЛ на профильные митогены; CD19 (В)-лимфоциты, несущие поверхностные иммуноглобулины разных классов; синтез иммунных глобулинов в культуре CD19 (В)-лимфоцитов; непрямой тест торможения миграции лейкоцитов; активность хелперных эффектов лимфоцитов, функциональную способность К и НК-клеток; наиболее значимые медиаторы иммунной системы, в том числе ИЛ; наличие иммунных комплексов, определение их молекулярной массы; присутствие различных компонентов комплемента; развернутую функцию фагоцитов.

Трехэтапная схема иммунного мониторинга. На первом этапе производится анкетный опрос для выявления первичной группы риска, учитывая наследственность, вид, интенсивность различных воздействий ксенобиотических факторов, наличие инфекционной, аллергической, аутоиммунной, лимфопролиферативной патологии.

На втором этапе выявляются грубые изменения иммунной системы и происходит формирование групп повышенного риска развития патологии. Определяется содержание в слюне, бактерицидная активность сыворотки крови, гетерофильные АТ слюны, обсемененность зева, гипоили гипертрофия миндалин, лимфатических узлов, целостность кожных покровов, слизистых оболочек, снижение абсолютного количества лейкоцитов, процента и абсолютного содержания лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов, содержание R-белка.

На третьем этапе идентифицируются повреждения того или иного звена иммунной системы и осуществляется подбор профильного иммунокорректора. Для этого оценивается количество Т-, В-лимфоцитов, их субпопуляций, содержание и активность натуральных киллеров, проводится реакция бласттрансформации с ФГА, выявляются иммунные глобулины, анализируется тест, структура HLA системы Аг; определяется чувствительность к модуляторам.

Существует трехэтапная оценка иммунного статуса по Нойд

(1987).

Тесты включают: 1-го уровня -определение количества и морфологии лимфоцитов; кожные тесты; определение уровня иммуноглобулинов и их субклассов; рентгенографию и рентгеноскопию лимфоидных органов.

2-го уровня - гистохимический анализ лимфоидных органов; анализ поверхностных маркеров мононуклеарных клеток с помощью моноклональных АТ, взаимодействующих с основными Аг мононуклеарных клеток; анализ пролиферативного ответа этих клеток на Т- и В-митогены и специфические антигены; анализ цитотоксичности (натуральные киллеры и Т-киллеры).

3-го уровня - определение активности энзимов (аденозиндезаминаза, пуриннуклеозидфосфорилаза), ассоциированных с иммунодефицитами; определение синтеза цитокинов (фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, ИЛ-1, ИЛ-2, В-клеточных ростовых факторов и т.д.); определение гормонов тимуса в сыворотке крови и других биологических жидкостях; анализ фагоцитоза; хемилюминесценции, поглощения и киллинга бактерий, адгезии и хемотаксиса; определение компонентов системы комплемента; анализ смешанных клеточных структур с целью определения иммуноглобулин-продуцирующей функции В-лимфоцитов; генетический и цитологический анализ хромосомного материала.

Нами предлагается следующая очередность действия для выявления иммунологически компрометированных лиц.

На начальном этапе производится диагностика иммунных расстройств на долабораторном уровне.

На основании опроса определяется один или сочетание нескольких синдромов: инфекционного, аллергического, аутоиммунного, иммунопролиферативного. При наличии одного синдрома пациент попадает в группу риска. В тех случаях, когда обнаруживается сочетание нескольких синдромов или поражение одновременно нескольких органов (систем), больной включается в группу повышенного риска.

На втором этапе проводится клиническая диагностика иммунных расстройств. Напомним, что эти состояния возникают: после перенесенной инфекции, нарушения питания, потребления нитратов и потерь белка, в результате ожогов, при любых хронических патологических процессах, особенно с локализацией в легких, сердечно-сосудистой системе, желудочно-кишечном тракте, мочеполовых путях, при системных заболеваниях соединительной ткани, после стрессов, обучения, у пожилых людей, детей и т.д.

На третьем этапе анализируется лейкограмма. Ведущим является снижение количества лейкоцитов, лимфоцитов и моноцитов более чем на треть. При этом необходимо учитывать, что изменение формулы крови может зависеть от патологического процесса, или приема медикаментов.

В упрощенной схеме определяют абсолютное количество только CD3 (Т)-клеток, снижение их содержания второй-третьей степени является свидетельством неблагополучия в иммунной системе: одновременно для оценки гуморального иммунитета рутинными биохимическими методами определяется γ-глобулиновый уровень в сыворотке крови и титры естественных (нормальных) АТ.

Далее исследуют иммунный статус тестами первого уровня (по Р.В. Петрову).

Пациентов с несоответствием выраженности клинической картины (тяжелое течение заболевания) с нормальными параметрами иммунного статуса или, наоборот, при наличии выраженных иммунных расстройств, даже при выраженной клинической ремиссии заболевания, обследуют расширенным набором тестов, оценивая количественные характеристики субпопуляций Т-лимфоцитов, т.е. используют тесты иммунного обследования второго уровня (по Р.В. Петрову).