Статьи Лабораторная диагностика
|
|
|
|
ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
Система гемостаза — это сложная биологическая система, основными функциями которой являются:1.остановка кровотечений путем поддержания структурной целостности стенок кровеносных сосудов и достаточно быстрого их тромбирования при повреждениях
2.сохранение жидкого состояния крови
Эти функции обеспечиваются тремя функционально-структурными компонентами системы гемостаза:
1.cтенками кровеносных сосудов
2.форменными элементами крови - тромбоцитами (в первую очередь)
3.плазменными ферментными системами - свертывающей, фибринолитической, калликреин-кининовой и др.
Различают два основных механизма остановки кровотечения при повреждении сосудов, которые могут функционировать одновременно и сопряженно:
I.Первичный, или сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, обусловленный спазмом сосудов и их механической закупоркой агрегатами тромбоцитов с образованием так называемого “белого тромба”.
II.Вторичный, или коагуляционный гемостаз, протекающий с использованием многочисленных факторов свертывания крови и обеспечивающий плотную закупорку поврежденных сосудов фибриновым тромбом (красным кровяным сгустком).
СОСУДИСТО-ТРОМБОЦИТАРНЫЙ ГЕМОСТАЗ
У здорового человека кровотечение из мелких сосудов при их повреждении останавливается за 1–3 минуты за счет:
•адгезии (прилипания) тромбоцитов - начальный этап сосудисто-тромбоцитарного гемостаза
•агрегации тромбоцитов
•спазма микрососудов (в меньшей степени)
Пусковую роль в этом процессе играет повреждение стенок кровеносных сосудов и обнажение субэндотелиальных тканевых структур, в частности, коллагена.
Под действием коллагена и содержащегося в субэндотелии так называемого фактора Виллебранда происходит быстрая активация тромбоцитов, которые, изменяя свою форму, набухая и образуя шиповидные отростки, прилипают (адгезируют) к волокнам соединительной ткани по краям раны.
Адгезия тромбоцитов к субэндотелию поврежденных кровеносных сосудов связана со взаимодействием трех его компонентов:
•специфических рецепторов мембран тромбоцитов - гликопротеина Iв, IIб, IIIа
•коллагена
•фактора Виллебранда и некоторых других белков - тромбоспондин, фибронектин (фибронектин образует своеобразные мостики между коллагеном субэндотелия сосудов и рецепторами (Iв) тромбоцитов)
Одновременно под влиянием АДФ, катехоламинов и серотонина, выделяющихся из поврежденных клеток, а также коллагена повышается способность тромбоцитов к агрегации.
При этом из тромбоцитов выделяются и начинают действовать вещества, содержащиеся в так называемых электронноплотных и a-гранулах тромбоцитов:
•большое количество АДФ
•серотонин
•адреналин
•некоторые белки, участвующие в агрегации и свертывании крови - антигепариновый фактор тромбоцитов IV, b-тромбоглобулин, пластиночный фактор роста и некоторые факторы свертывания, аналогичные плазменным - фибриноген, факторы V и VIII, калликреин, a2-антиплазмин и др.
!!! Реакция освобождения биологически активных веществ из тромбоцитов и поврежденных клеток сосудов имеет 2 важных следствия:
•под влиянием АДФ, серотонина и адреналина резко усиливается процесс агрегации тромбоцитов
•под влиянием серотонина, адреналина и др. возникает спазм поврежденного микрососуда.
В процессе разрушения тромбоцитов из них выделяются некоторые важные факторы свертывания:
•тромбоцитарный фактор III (тромбопластин)
•антигепариновый фактор IV
•фактор Виллебранда
•фактор V
•b-тромбоглобулин
•ростковый фактор
•a2-антиплазмин
•фибриноген и др.
Многие из них аналогичны соответствующим факторам свертывания.
!!! Следует помнить, что тромбоциты, оказывая большое влияние на интенсивность и скорость локального свертывания в зоне тромбообразования, меньшее влияние оказывают и на процесс свертывания крови вообще - сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз являются взаимосвязанными (сопряженными), но все же относительно независимыми процессами.
В результате взаимодействия плазменных и высвобождающихся пластиночных факторов и тканевого тромбопластина начинается процесс свертывания крови.
В зоне первичного гемостаза образуются вначале малые количества тромбина, который с одной стороны завершает процесс необратимой агрегации тромбоцитов, а с другой способствует образованию фибрина, который вплетается в тромбоцитарный сгусток и уплотняет его.
Важную роль в формировании тромбоцитарной агрегации играют производные арахидоновой кислоты:
•в тромбоцитах образуется тромбоксан А2 - мощный агрегирующий и сосудосуживающий эффект
•в сосудистой стенке образуется простациклин (PGI2) - основной ингибитор агрегации
заключение
Наиболее важными факторами, обеспечивающими первичный сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, являются:
1)число тромбоцитов в крови
2)фактор Виллебранда, способствующий адгезии и агрегации тромбоцитов
3)наличие в мембранах тромбоцитов специфического рецептора (гликопротеина Iв), обеспечивающего вместе с фактором Виллебранда адгезию пластинок к коллагеновым волокнам поврежденного сосуда
4)наличие в мембранах активированных тромбоцитов рецепторов (гликопротеины IIв и IIIа), вступающих в специфическую реакцию с фибриногеном тромбоспондином и другими белками, что имеет значение в формировании необратимой агрегации пластинок
5)нормальный синтез в тромбоцитах из арахидоновой кислоты тромбоксана А2 и простациклина
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ сосудисто-тромбоцитарного гемостаза
Выбор методов оценки сосудисто-тромбоцитарного гемостаза зависит в первую очередь от:
•клинической картины заболевания
•склонности больного к кровотечениям или тромбозам
Существуют тесты оценки первичного гемостаза:
•основные (базисные)
•дополнительные
Ниже приведено описание наиболее распространенных базисных методов исследования.
1. Резистентность (ломкость) капилляров
Манжеточная проба Румпель-Лееде-Кончаловского
Манжету для измерения АД накладывают на плечо, создавая в ней постоянное давление, равное 100 мм рт. ст. Через 5 минут оценивают результаты пробы:
•при отсутствии нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза ниже манжеты появляется лишь небольшое количество петехиальных (мелкоточечных) кровоизлияний - менее 10 петехий в зоне, ограниченной окружностью диаметром 5 см
•при повышении проницаемости сосудов или тромбоцитопении число петехий в этой зоне превышает 10 - положительная проба
2. Время кровотечения
Многочисленные модификации теста основаны на точном измерении длительности кровотечения из ранки на мочке уха, мякоти ногтевой фаланги пальца руки или верхней трети ладонной поверхности предплечья.
2.1 Метод Дьюка
Стерильным скарификатором или плоским ланцетом прокалывают нижний валик мочки уха (глубина прокола 3,5—4 мм) и включают секундомер. Предварительно мочку уха согревают между пальцами. Выступающие капли крови каждые 30 с промокают фильтровальной бумагой, не прикасаясь к ранке. Как только наступит момент, когда новые капли крови не образуются, выключают секундомер и определяют общую длительность кровотечения, а также оценивают размеры капель.
!!! В норме время кровотечения по Дьюку не превышает 4 мин. Его увеличение наблюдается при выраженных тромбоцитопениях или/и тяжелых нарушениях их функции (тромбоцитопатиях). Следует помнить также, что у 60% больных с этой патологией тест оказывается отрицательным, и время кровотечения нормально.
2.2 Метод Айви
Несколько более чувствительным является тест Айви, когда оценивают время кровотечения из надрезов на коже ладонной поверхности верхней трети предплечья на фоне искусственного повышения венозного давления с помощью манжеты для определения АД, в которой поддерживают давление 40 мм рт. ст. По ходу предплечья прикладывают соответствующий шаблон и скальпелем делают два надреза длиной 9 мм и глубиной 1 мм. Засекают время. Не касаясь надрезов, осторожно промакивают кровь фильтровальной бумагой каждые 30с до остановки кровотечения в обеих ранках. Рассчитывают среднее время по двум надрезам. В норме время кровотечения по Айви не превышает 8 минут.
Референтные значения
В норме время кровотечения составляет 3-6 мин (СИ: 3-6 мин) при использовании метода шаблона 3-6 мин при оценке по Айви (СИ: 3-6 мин) 1-3 мин (СИ: 1-3 мин) при оценке по Дьюку.
3. Подсчет числа тромбоцитов
Наибольшее распространение в настоящее время получили три метода подсчета тромбоцитов в крови:
•подсчет в камере Горяева
•подсчет в мазках крови
•электронно-автоматический метод
3.1 Метод подсчета тромбоцитов в камере Горяева
Является самым точным, но достаточно трудоемким. Подсчет тромбоцитов в 1 л проводится по стандартной методике с учетом разведения крови и объема большого квадрата счетной сетки Горяева с применением фазово-контрастного микроскопа для лучшего контрастирования тромбоцитов.
Исследуемую кровь разводят в 200 раз раствором аммония оксалата или раствором, содержащим кокаина гидрохлорид, натрия хлорид, фурациллин и дистиллированную воду. Разведенную кровь перемешивают и оставляют на 30 минут для гемолиза эритроцитов. Затем заполняют камеру Горяева и подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах. Практически для расчета количества тромбоцитов в 1 л крови число сосчитанных в 25 больших квадратах кровяных пластинах умножают на 2х106.
3.2 Метод подсчета тромбоцитов в окрашенных мазках крови основан на подсчете числа тромбоцитов на 1000 эритроцитов с последующим пересчетом на 1 л крови.
Кровь смешивают с раствором магнезии сульфата или ЭДТА. Мазки готовят на предметных стеклах и окрашивают их по Романовскому-Гимзе. В каждом поле зрения микроскопа подсчитывают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов. Зная число эритроцитов в 1 л крови, рассчитывают количество тромбоцитов в этом объеме.
3.3 Автоматический метод подсчета тромбоцитов с использованием современных электронных приборов значительно облегчает и ускоряет исследование, в связи с чем находит в последние годы все большее распространение в клинической практике.
4. Ретракция сгустка крови
В клинической практике чаще используют непрямые методы оценки ретракции сгустка. Один из них заключается в определении объема сыворотки, выделяемой при ретракции сгустка крови, по отношению к объему плазмы исследуемой крови.
В градуированную центрифужную пробирку набирают 5 мл крови, опускают в нее деревянную палочку и помещают пробирку в водяную баню. В исследуемой крови определяют показатель гематокрита. Через 1 ч после свертывания крови сгусток, прикрепившийся к палочке, удаляют, дав жидкой части стечь обратно в пробирку. Далее измеряют объем жидкости, оставшейся в пробирке, центрифугируют ее при 3000 об/мин в течение 5 минут и измеряют объем осевших эритроцитов. Искомый объем сыворотки определяют по разнице между объемом оставшейся в пробирке жидкости и объемом эритроцитов.
Ретракцию сгустка рассчитывают по формуле:
Ретракция сгустка = ОС/ОП;
где ОС — объем сыворотки после ретракции сгустка
ОП — объем плазмы перед началом исследования
Объем плазмы можно определить следующим образом:
ОП = ОК х (100 - Ht)/100
где ОК — объем исследуемой крови
Ht — гематокрит
Объем сыворотки крови после ретракции сгустка всегда меньше объема плазмы перед началом исследования, так как часть жидкой части крови остается в сгустке. Чем больше сокращается сгусток, тем больше в пробирке образуется сыворотки, и наоборот.
В норме ретракция сгустка составляет 40—95%. Ее уменьшение наблюдается при выраженных тромбоцитопениях и тромбастении Гланцмана.
5. Определение ретенции (адгезивности) тромбоцитов
Среди многочисленных методов определения адгезивности тромбоцитов наибольшее распространение получил метод определения ретенции на стеклянных шариках. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в венозной крови до и после ее пропускания с определенной скоростью через стандартную колонку со стеклянными шариками.
Для исследования берут свежевзятую цитратную кровь. В полиэтиленовый или силиконированный стеклянный шприц набирают 2 мл крови, присоединяют к нему полихлорвиниловую трубку (колонку) со стеклянными шариками диаметром 0,2–0,4 мм и устанавливают шприц в инфузионный насос, позволяющий опорожнять шприц со скоростью 2 мл в минуту. Количество тромбоцитов определяют дважды: до и после пропускания крови через колонку со стеклянными шариками.
Индекс ретенции (адгезивности) тромбоцитов рассчитывают по следующей формуле:
ИР = (А-В/А)х100(%),
где ИР — индекс ретенции (адгезивности)
А — количество тромбоцитов в крови до пропускания
В — количество тромбоцитов в крови после пропускания через колонку
У здоровых людей индекс ретенции составляет 20–55%. Уменьшение этого показателя свидетельствует о нарушении адгезии тромбоцитов и встречается при многих врожденных тромбоцитопатиях (тромбастения Гланцмана, болезнь Бернара-Сулье, болезнь Виллебранда и др.).
6. Исследование агрегации тромбоцитов
Представление об агрегационной способности тромбоцитов можно составить с помощью:
6.1 Качественных методов (общее ориентировочное представление об агрегационной активности) - основанны на визуальном определении тромбоцитарных агрегатов, образующихся при смешивании тромбоцитарной плазмы с различными, чаще естественными, стимуляторами агрегации.
•в пробирке - макроскопический метод
•на предметном стекле - микроскопический метод по А. С. Шитиковой
В качестве стимуляторов агрегации используют растворы АДФ, тромбина, адреналина, коллагена, ристомицина. Регистрируют время образования крупных агрегатов тромбоцитов, которое в норме обычно не превышает 10–60 с.
6.2 Количественная фотометрическая или спектрофотометрическая регистрация процесса агрегации с помощью агрегографов различной конструкции - наиболее полная оценка агрегационной способности тромбоцитов.
Методы заключаются в графической регистрации изменения оптической плотности тромбоцитарной плазмы при перемешивании ее со стимуляторами агрегации. Образование тромбоцитарных агрегатов ведет к увеличению светопропускающей способности тромбоцитарной плазмы.
Полученные агрегатограммы анализируют по нескольким количественным параметрам:
•по времени начала агрегации после добавления соответствующего стимулятора
•по амплитуде агрегатограммы на 2-й и 6-й минутах
•по общей площади агрегатограммы и др.
В зависимости от используемого стимулятора и его дозы агрегатограмма может иметь различную форму:
•при использовании в качестве стимуляторов агрегации тромбоцитов коллагена, тромбина, ристомицина регистрируют одну большую волну агрегации
•при добавлении к тромбоцитарной плазме малых доз АДФ — двухволновую агрегатограмму
На агрегатограммах, полученных при использовании в качестве стимулятора малых доз АДФ:
•первая волна регистрируемой кривой отражает начальную агрегацию тромбоцитов, обусловленную введением извне стимулятора этого процесса
•вторая волна связана с реакцией высвобождения из тромбоцитов собственных биологически активных веществ (адреналина, АДФ, тромбоксана А2 и др.), которые усиливают начавшуюся агрегацию кровяных пластинок
!!! Отсутствие на агрегатограммах, полученных при использовании в качестве стимулятора малых доз АДФ, второй волны агрегации свидетельствует об уменьшении в тромбоцитах гранул, содержащих биологически активные вещества (недостаточность пула хранения), или о нарушении реакции высвобождения этих веществ из тромбоцитов.
Принципы диагностики нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза
Во многих клинических случаях диагностика конкретной причины кровоточивости, обусловленной дефектом сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, достаточно сложна и в ряде случаев требует использования в диагностике сложных лабораторных методов исследования функции и микроструктур тромбоцитов, не нашедших пока широкого клинического применения.
Тем не менее при проведении диагностического поиска следует учитывать несколько важных принципов:
•Обследование больных с повышенной кровоточивостью следует начинать с определения наиболее простых показателей: количества тромбоцитов в крови, их размеров, длительности кровотечения.
•Если выявляется тромбоцитопения, первый этап дифференциальной диагностики должен быть направлен на исключение у больного аплазии кроветворения, гемобластозов, В12-дефицитной анемии, болезни Маркиафавы-Микели, метастазов рака в костный мозг, а также ДВС-синдрома. С этой целью проводятся такие исследования как стернальная пункция, трепанобиопсия, гастродуоденоскопия, рентгенологическое исследование легких, УЗИ-исследование и др.
•Если названная патология отсутствует, необходимо последовательно исключить возможность гетероиммунной формы заболевания (реакция на лекарственные препараты или на острую вирусную инфекцию) и симптоматических аутоиммунных форм заболевания, развившихся на фоне другого основного патологического процесса: системной красной волчанки, ревматоидного артрита, хронического лимфолейкоза, хронического активного гепатита, цирроза печени и др.
•Если результаты этого диагностического поиска оказались отрицательными, следует думать о возможной аутоиммунной идиопатической тромбоцитопенической пурпуре. В этих случаях диагноз подтверждается:
-отсутствием признаков болезни в раннем детстве у пациента и у кровных родственников
-хорошим эффектом кортикостероидной терапии
-другими более сложными методами исследования функции тромбоцитов, например методом Диксона, в основе которого лежит количественное определение антител на поверхности тромбоцитов.
•Если при подсчете тромбоцитов в крови их число оказалось нормальным, то с определенной долей вероятности следует проводить диагностический поиск заболеваний, в основе которых лежит нарушение функций тромбоцитов — тромбоцитопатий. С этой целью необходимо определить способность кровяных пластинок к адгезии и агрегации с различными стимуляторами (АДФ, адреналин, коллаген, бычий фибриноген и ристомицин). Ориентируясь на данные, представленные в специальных таблицах справочников по лабораторной диагностике и учитывая результаты других клинических, лабораторных и инструментальных тестов, а также данные анамнеза, вполне возможна диагностика основных форм тромбоцитопатий.
•Наконец, при обнаружении признаков нарушенного высвобождения целесообразно прибегнуть к более сложным методам исследования, включая электронную микроскопию.
далее: коагуляционный гемостаз, лабораторная диагностика показателей коагуляционного гемостаза