Статьи Лабораторная диагностика
|
|
|
|
Методы диагностики Helicobacter pylori (НР)
ВВЕДЕНИЕВажной особенностью Helicobacter pylori является тропность к поверхностному эпителию слизистой оболочки желудка: адгезия этих микроорганизмов в слизистую оболочку двенадцатиперстной кишки возможна только в тех случаях, когда происходит метаплазия желудочного эпителия в двенадцатиперстную кишку. Оптимальной для внедрения и активации Helicobacter pylori в слизистой оболочке является рН от 4 до 8. Более кислое желудочное содержание (рН < 3,5) приводит к инактивации микроорганизма. Поэтому излюбленной локализацией Helicobacter pylori является антральный отдел желудка, где обычно происходит полная или частичная нейтрализация свободной НСl слизистым секретом. НР располагается в слизистой оболочке под слоем слизи. Отчетливо выраженная уреазная активность микроорганизма позволяет разлагать мочевину, окружая себя аммиаком, защищающим его от воздействия НСl. В биопсийном материале Helicobacter pylori имеют спиралевидную, изогнутую, S-образную форму. Это интенсивно окрашенные бактерии с жгутиками на одном конце. Helicobacter pylori вырабатывает целый ряд веществ, обладающих прямым цитотоксическим эффектом на слизистую оболочку желудка, вызывая ее воспаление, а в дальнейшем, при распространении патологического процесса на более глубокие слои слизистой оболочки, - атрофию железистого аппарата. При длительном инфицировании Helicobacter pylori патологический процесс из антрального отдела распространяется на тело желудка, что сопровождается выраженными явлениями атрофии слизистой оболочки (пангастрит). У больных, инфицированных Helicobacter pylori, нередко развивается хронический активный гастродуоденит, чаще пилородуоденит. Дуоденит развивается под воздействием Helicobacter pylori на фоне хеликобактерного гастрита и метаплазии желудочного эпителия в двенадцатиперстную кишку. Причиной такой метаплазии слизистой двенадцатиперстной кишки считают заброс избыточно кислого желудочного содержимого в двенадцатиперстную кишку в связи с гиперсекрецией НСl. Обсеменение Helicobacter pylori происходит именно в участках желудочной метаплазии слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. На фоне активного гастрита и хронического активного дуоденита, ассоциированных с НР, наблюдается значительное снижение резистентности слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки к воздействию различных агрессивных факторов, в первую очередь, кислотно-пептического. В результате развиваются язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ Helicobacter pylori
Наиболее распространенными из них являются цитологический, уреазный и гистологический методы.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ метод исследования
Материалом для цитологического исследования служат мазки-отпечатки биоптатов, полученные при эндоскопии из участков слизистой оболочки антрального отдела желудка или двенадцатиперстной кишки с наиболее выраженными морфологическими изменениями (гиперемия, отек и т.п.). Мазки высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Папенгейму или метанолазурэозиновой смесью. Микроскопия окрашенных мазков-отпечатков позволяет выявить наличие Helicobacter pylori и ориентировочно оценить количество микроорганизмов.
Выделяют три степени обсемененности слизистой оболочки:
I.слабая (+) - до 20 микробных тел в поле зрения
II.средняя (++) - от 20 до 40 микробных тел в поле зрения
III.высокая (+++) - более 40 микробных тел в поле зрения
УРЕАЗНЫЙ ДЫХАТЕЛЬНЫЙ тест
В развитых странах в последние годы стандартным методом контроля за эрадикацией стал уреазный дыхательный тест, который основан на способности уреазы разлагать мочевину до НСО3 ¯ и NH4 +. Из НСО3¯ образуется СО2, который, попадая в кровоток, затем транспортируется в легкие. Для проведения УДТ необходима мочевина, меченная радиоактивным углеродом ¹³С или 14С. Чаще в клинической практике применяется нерадиоакивный стабильный углерод ¹³С. 14С используется реже, так как является источником излучения низкоэнергетических β-частиц, которые обнаруживаются сцинтилляционным счетчиком. Изотоп количественно определяют газовым хроматомасс-спектрометром или с помощью инфракрасного и лазерного оборудования.
В начале исследования берутся 2 фоновые пробы выдыхаемого воздуха. Далее пациент съедает легкий завтрак и тестовый субстрат; в течение 1 часа, с интервалами в 15 минут, у него берут 4 пробы выдыхаемого воздуха. Уровень радиоактивного изотопа в выдыхаемом воздухе определяют в течение 10-30 минут. Затем пробирки направляются на масс-спектрометрию. Результат выражается как приращение ¹³СО2 – δ¹³СО 2, его экскреция (‰) и считается положительной при значениях выше 5‰.
В ряде стран используется определение изотопного отношения концентраций ¹³СО2/¹²СО2, что позволяет свести к минимуму влияние на конечный результат методических и инструментальных погрешностей.
При использовании дыхательного уреазного теста ложноположительные результаты считаются редкими (4-10%), ложноотрицаельные результаты возможны у пациентов, принимавших перед исследованием антисекреторные и висмутсодержащие препараты, которые ингибируют уреазу бактерий, в связи с чем рекомендуется осуществлять диагностику эрадикации уреазными методами не ранее чем через месяц после приема этих препаратов.
Метод быстрый, удобный, но ограничен в распространении из-за необходимости использовать дорогостоящее оборудование и изотопные препараты. Поскольку уменьшение стоимости изотопа невозможно, были предложены варианты масс-спектрометров на основе лазерного и инфракрасного излучения, стоимость которых существенно ниже. С другой стороны, использование микрокапсул для упаковки мочевины, меченной радиоактивным изотопом, позволило свести к минимуму трудности, связанные с хранением, утилизацией и безопасностью данного изотопа. В США продажа микрокапсул с мочевиной, меченной углеродом, разрешена FDA наравне с обычными лекарственными препаратами через аптечную сеть, что является свидетельством полной безопасности данного изотопа для обследуемых и окружающей среды. Появление такой формы меченной мочевины существенно повышает конкурентноспособность этой методики, т.к. стоимость и самого изотопа, и оборудования для его проведения в среднем меньше в 10 раз, чем масс-спектрометра.
БЫСТРЫЙ УРЕАЗНЫЙ тест
Уреазный тест («кампи-тест») относится к числу экспресс-методов выявления Helicobacter pylori.
Стандартный «кампи-тест» состоит из:
•содержащего мочевину геля-носителя
•раствора азида натрия
•раствора фенол-рота - используется в качестве индикатора рН, который при сдвиге рН среды в щелочную сторону меняет свой цвет от желтого к малиновому; сдвиг рН происходит в том случае, если под действием хеликобактерной уреазы происходит гидролиз мочевины с образованием аммиака
В качестве источника хеликобактерной уреазы используют биоптаты слизистой оболочки, которые помещают в луночку специальной плашки из синтетического материала, заполненную готовой стерильной средой.
Появление малинового окрашивания теста свидетельствует о наличии в биоптате микробных тел Helicobacter pylori.
О количестве Helicobacter pylori в биоптате косвенно судят по времени изменения окраски теста:
•значительное инфицирование слизистой оболочки НР (+++) - малиновая окраска теста появляется в течение 1 часа от начала исследования
•умеренное инфицирование слизистой оболочки НР (++) - окраска индикатора изменяется через 2–3 часа
•незначительное инфицирование слизистой оболочки НР (+) - малиновое окрашивание теста появляется к концу суток
Более позднее окрашивание теста относят к отрицательным результатам.
При проведении уреазного теста нужно учитывать и тот факт, что он может быть положительным у лиц, желудок которых колонизирован Helicobacter heilmanii, имеющим близкое сродство с Helicobacter pylori.
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ методы ("золотой стандарт" диагностики)
Данные методы методы исследования биоптатов, наряду с возможностью детального изучения морфологических изменений в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишки, позволяют выявить Helicobacter pylori при обычной окраске по Романовскому–Гимзе. При эндоскопии биоптаты берут прицельно из антрального отдела желудка в 2–3 см от привратника и из участка с наиболее выраженными воспалительными изменениями слизистой.
Различные новые модификации этого метода, в частности, иммуноцитохимический метод с применением моноклональных антител или метод гибридизации ДНК, дают возможность не только существенно повысить чувствительность и специфичность гистологического выявления Helicobacter pylori, но и идентифицировать различные штаммы Helicobacter pylori, что важно для выяснения природы повторного инфицирования слизистой оболочки после эффективного антихеликобактерного лечения.
ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ микроскопия
Helicobacter pylori может быть обнаружен до микробиологического или гистологического исследования при помощи фазово-контрастной микроскопии. Этот метод весьма удобен для обнаружения Helicobacter pylori, при условии достаточно высокой степени обсеменения.
Преимущества фазово-контрастной микроскопии:
•нет необходимости проводить фиксацию материала и дополнительных окрасок ткани
•исследование можно проводить в обычных лабораторных условиях
•результат может быть получен через 1-2 мин.
Процедура выполнения исследования:
•поместить биоптат на предметное стекло
•измельчить биоптат на стекле и добавить каплю физиологического расвора
•поместить на измельченный биоптат покровное стекло
•оместить приготовленный препарат в фазово-контрастный микроскоп
Микроскопия проводится с увеличением в 100 раз с спользованием иммерсионного масла. В препарате - типичные изогнутые бактерии в хаотичном движении.
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ методы
Иммунологические методы основаны на выявлении у больных, инфицированных Helicobacter pylori, специфических антител, которые можно обнаружить в сыворотке крови уже через 3–4 недели после инфицирования. Достаточно высокий титр антител сохраняется даже в периоде клинической ремиссии заболевания. Отрицательным тест становится после успешного антибактериального лечения, что позволяет использовать метод для контроля эффективности такой терапии. Для выявления специфических антител используют различные методики, в частности, метод иммуноферментного анализа (ИФА) с определением антител IgG и IgA классов в сыворотке крови.
При оценке результатов иммунологического анализа следует помнить, что антитела к различным антигенам бактерии могут присутствовать в крови на протяжении года после эрадикации бактерий, что не позволяет применять методы для контроля результатов антигеликобактерного лечения.
Иммуногистохимический метод
Биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, обрабатывается моноклональными антителами против Helicobacter pylori. Готовые к применению коммерческие наборы с моноклональными антителами работают при разведении 1:200000 и избирательно окрашивают только Helicobacter pylori. Этот метод хорошо зарекомендовал себя при исключительно низкой степени обсемененности слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori, когда морфологический метод и уреазный тест дают ложноотрицательные или сомнительные результаты. Он также используется для выявления морфологически измененных (кокковых форм) Helicobacter pylori.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ метод
Наибольшую информацию о Helicobacter pylori возможно получить только при выделении его из прижизненных биопсийных образцов. Это единственный метод исследования, обладающий 100% специфичностью. При этом виде исследования возможно не только выделение чистой культуры Helicobacter pylori и ее идентификация, но и изучение морфологических, биохимических и биологических свойств возбудителя.
Бактериологический метод исследования дает возможность определять антибиотикорезистентность у Helicobacter pylori и проводить за ней динамические наблюдения. Без бактериологического метода планировать клиническое испытание лекарственных препаратов, учитывая причины неудачи эрадикации, нельзя, так как основная причина, снижающая процент эрадикации – антибиотикорезистентность Helicobacter pylori.
В эпидемиологической практике выделение чистой культуры Helicobacter pylori необходимо для внутривидового типирования штаммов, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, которое может быть обусловлено тем же штаммом.
В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности Helicobacter pylori, изготовлять препараты для серологической диагностики, создать банк штаммовдля эпидемиологических и других исследований, так как штаммы бактерии в замороженном виде при температуре -70°С могут храниться в течение 5-7 лет. Без этого метода невозможно дальнейшее научное изучение микроорганизма. Однако этот метод достаточно дорогой. Кроме того, он сопряжен с определенными трудностями, обусловленными необходимостью наличия специальных сред, оптимальной температуры, влажности, качества атмосферного воздуха и т.д. Это приводит к тому, что рост колоний микроорганизмов удается получить далеко не всегда. Неудобство метода связано и с тем, что его результатов приходится ждать, как правило, не менее 10-14дней. В клинической практике он применяется в основном вслучаях инфекции Helicobacter pylori, резистентной к обычным схемам антигеликобактерной терапии.
Helicobacter pylori крайне «капризен», требует специальных условий культивирования и дорогостоящего оборудования. Большой шаг вперед в успешном культивировании Helicobacter pylori принадлежит транспортным средам, которые дают возможность продлить сроктранспортировки биоптата из эндоскопического кабинета вмикробиологическую лабораторию до суток (среды Стюарта, Кэри-Блэйера, Био Мерьо).
Посевы инкубируются при температуре 37°С, влажности 98%, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. Helicobacter pylori растет в атмосфере, содержащей 5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное составляет азот. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Многие штаммы Helicobacter pylori могут расти и развиваться в достаточно широком диапазоне температур при +32°С... +39°С, но не растут при +27°С ...+42°С. Время инкубации: первичное исследование – 7 дней, контроль лечения - 14 дней.
На неселективной питательной среде Helicobacter pylori на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии Helicobacter pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида. При появлении колоний, сходных по морфологии с Helicobacter pylori (диаметром до 0,5 – 2 мм в виде «капель росы» или при сплошном росте, образующие прозрачную пленку), происходит их идентификация. Предложена методика полуколичественного определения обсеменения слизистой оболочки желудка в зависимости от числа выросших микробных колоний: до 10 колоний в чашке (1+), 10-20 колоний (2+), 20-50 колоний (3+), более 50 колоний (4+).
Для идентификации мазки окрашивают по Граму. Под микроскопом в случае Helicobacter pylori обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки. Проводят биохимическое типирование – уреазная, каталазная, оксидазная активность, Helicobacter pylori не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
Метод предназначен для качественного обнаружения ДНК Helicobacter pylori в биологических образцах (биоптаты антрального отдела желудка, биоптаты двенадцатиперстной кишки, биоптаты десен, мазки из зубодесневого кармана, слюна.). Позволяет оценить генотипические и фенотипические характеристики возбудителя. Почти у каждого пациента имеется уникальный штамм Helicobacter pylori. Выявлено, что вирулентность Helicobacter pylori во многом обусловливает клинические проявления инфекции. Существует ряд генов, продукты которых – белки Cag A, Vac A, Ice A, Bab A – полагают факторами патогенности. В зависимости от их наличия выделяютдва типа штаммов Helicobacter pylori. Экспрессирующие Cag A- и Vac A-токсин относятся к первому типу, штаммы второго типа не экспрессируют указанные гены и считаются менее патогенными. Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике.
ПЦР (относится к молекулярно-биологическим методам) представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК-полимеразой.
Метод ПЦР в средах позволяет идентифицировать Helicobacter pylori без выделения чистой культуры по присутствующим в исследуемом материале фрагментам его генома.
В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.
_____________________________________________________________________________
ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АЛГОРИТМ
Какой именно метод выбрать для первичной диагностики инфекции, зависит от конкретной клинической ситуации, возможностей лечебного учреждения, состояния пациента. Полученные результаты во многом зависят от соблюдения правил забора биологического материала, условий и сроков его хранения, консервации и транспортировки в лабораторию для каждого конкретного исследования. Даже при соблюдении этих правил, каждый из методов имеет свои пределы диагностических возможностей, которые отражены в их основных рабочих характеристиках. Точность метода определяется его чувствительностью (инфекция диагностируется, когда она есть) чем она выше, тем меньше процент ложноположительных результатов и специфичностью (инфекция не диагностируется, когда ее нет) чем она выше, тем меньше процент ложноотрицательных результатов.
Если имеются показания к проведению диагностической эндоскопии (язвенная болезнь желудка, язвенное кровотечение, геморрагический гастрит, новообразования желудка и др.), то на фоне прицельной биопсия слизистой оболочки из преддверия привратника (из одного участка) и тела (из двух участков - передняя и задняя стенки) желудка - наиболее предпочтительными методами для выявления Helicobacter pylori считаются:
•проведение гистологического исследования - фиксация и окраска препаратов для гистологического исследования обычно занимают несколько дней
•определение уреазной активности (ускоренные уреазные тесты) - оценка результата уреазного теста занимает несколько часов
По особым показаниям могут быть проведены (перечисленные исследования являются трудоемкими, дорогостоящими и пока еще используются редко):
•посев бактериальной культуры
•полимеразная цепная реакция (ПЦР)
•уреазный дыхательный тест
Если диагноз, например язвенная болезнь желудка, был установлен ранее, во время эзофагогастродуоденоскопии, то методом выбора для выявления инфицирования слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori могут быть (данные методы неинвазивны и достаточно точны):
•серологический (иммунологический) тест
•уреазный дыхательный тест
Само по себе выявление Helicobacter pylori в слизистой оболочке не всегда свидетельствует о наличии заболеваний желудка или двенадцатиперстной кишки, ассоциированных с этим инфекционным агентом. Обсеменение слизистой оболочки может встречаться и у совершенно здоровых людей, генетически невосприимчивых к Helicobacter pylori, у которых бактерия не способна к адгезии на эпителии. Значение имеют случаи сочетания инфицирования Helicobacter pylori и характерных эндоскопических признаков хронического антрального гастрита, пангастрита, хронического активного дуоденита, язвенной болезни желудка и язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.