Статьи Лабораторная диагностика
|
|
|
|
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) – это метод ферментативного получения амплификаций (большого количества копий) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити), при этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК, поскольку только этот участок соответствует заданным условиям и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.
Для осуществления, указанных в определении процессов, необходимы три ключевых компонента: (1) служащая матрицей молекула ДНК, содержащая исследуемый фрагмент; (2) ДНК-полимераза*, то есть фермент для производства копий ДНК и нуклеотиды, используемые ДНК-полимеразой для синтеза ДНК; (3) два праймера ПЦР** – два коротких сегмента однонитевой нуклеиновой кислоты, комплементарных началу исследуемого фрагмента ДНК (обычно это последовательности из 15-20 оснований, присоединяясь к этому фрагменту, праймеры позволяют запустить синтез ДНК, поскольку ДНК-полимераза способна только добавлять звенья).
* процедура ПЦР включает несколько высокотемпературных этапов, поэтому используются термостабильные ДНК-полимеразы; они выделяются из термостойких бактерий, живущих в горячих источниках при температурах до 90°С; чаще всего это Taq-полимераза бактерий Thermus aquanticus, Tth-полимераза (Thermus thermophilus), Pwo-полимераза (Pyrococcus woesei); в настоящее время в ПЦР часто используются смеси полимераз с различными свойствами, включая искусственно полученные модификации природных ферментов
** праймеры можно заказать в биохимической компании или синтезировать с помощью автоматизированного аппарата, задав программу требуемой последовательности нуклеотидов
Так как процесс ПЦР требует постоянной смены циклов с несколькими разными температурами, современные аппараты для ПЦР – термоциркуляторы - работают в режиме быстрого изменения температуры реакционной смеси по заданной программе и способны амплифицировать фрагмент ДНК длиной от 100 до 3000 пар оснований в течение нескольких часов, начиная с микрограмма ДНК (что оптимально), но могут начать процесс и с миллионной доли микрограмма. В крайнем случае, можно использовать в качестве исходного материала ДНК из одной клетки, такой как клетка спермы, и получить более 100 млрд. копий исследуемого фрагмента.
Помимо простого увеличения числа копий ДНК ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом: изменение оснований, сращивание фрагментов ДНК и т.д.
Проведение ПЦР-анализа (PCR diagnostics) начинается с забора материала для исследования. Забранный материал со щеточки помещают в контейнер с физраствором. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР - лабораторию.
Проведение в лаборатории ПЦР-анализа происходит в три этапа: (1) выделение ДНК; (2) амплификация ДНК-фрагментов; (3) детекция ДНК-продуктов амплификации.
(1) Выделение ДНК - это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК. Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно. Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5-2 часа.
(2) Амплификация ДНК. Для осуществления следующего этапа ДНК-диагностики - амплификации ДНК — врачи используют так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК инфекций, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Уже упоминалось, что наличие полной ДНК инфекции необязательно, для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только данному микробу (инфекции). В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК - репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК. Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла - 4, после третьего - 8, после четвертого - 16, затем 32, 64, 128, 256… С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати - на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии - снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция. Путем присоединения к цепи ДНК праймеров - искусственно синтезированных «кусочков» ДНК (нуклеотидных пар), аналогичных ДНК микробов (инфекции) - образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК. Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка - ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК. Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны, т. е. присущи только определенному организму. Нет необходимости достраивать всю цепь ДНК, чтобы увидеть возбудителя инфекции. Нужен только тот участок, который характерен для данной бактерии как для индивидуальности. Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование - ПЦР - термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. В зависимости от программы и вида определяемой инфекции процесс автоматизированной ПЦР занимает от 2 до 3 часов.
(3) В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флуоресцировать - отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК вирусов, микробов или бактерий в забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.
Метод ПЦР (в диагностике инфекционных заболеваний) обладает следующими преимуществами:
1 Прямое определение возбудителей инфекционных заболеваний. Многие традиционные методы лабораторной диагностики подразумевают выявление возбудителей заболевания по различным косвенным признакам. Например, ИФА-диагностика основана на обнаружении в крови пациента белков, являющихся продуктами распада инфекционных возбудителей, на основании чего врач может поставить тот или иной диагноз. Метод ПЦР-анализа дает прямое указание на присутствие в забранном у пациента материале специфического участка ДНК возбудителя болезни.
2 Высокая специфичность ПЦР-диагностики. В процессе проведения анализа в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК, специфичный, т. е. присущий только конкретному возбудителю - только определенной бактерии или вирусу. Данный участок ДНК уникален и не характерен ни для одной инфекции на земле.
3 Высокая чувствительность ПЦР. Обнаружение инфекции возможно даже в том случае, если в забранном у пациента материале содержится лишь одна клетка бактерии или вируса. По сравнению с другими иммунологическими и микробиологическими методами диагностики: чувствительность ПЦР-анализа — 10—100 клеток в пробе, другие методы - 103—105 клеток.
4 Универсальность ПЦР-анализа. Для ПЦР-исследования может применяться практически любые материалы, в том чиле недоступные для исследования другими методами: слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток - поскольку инфекция может содержаться в любых биологических выделениях и тканях.
5 Высокая скорость получения результата ПЦР-анализа. Единый для всех метод обработки забранного на анализ у пациента материала, детекции продуктов реакции, автоматизированная ПЦР-амплификация позволяются провести полную ПЦР-диагностику за 4—5 часов. В тоже время, на культуральные методы исследования затрачивается гораздо больше времени — от нескольких дней до нескольких недель, поскольку необходимо выделение, а затем и выращивание возбудителя на культуре клеток.
6 Возможность диагностики любого вида инфекции. Высокая чувствительность метода ПЦР позволяет диагностировать инфекцию не только на острой стадии заболевания, но и хронические инфекции и даже наличие единичных бактерий или вирусов.
Говоря о несомненном прогрессивном значении метода ПЦР и его неоспоримых преимуществах, вместе с тем, следует знать и об определенных недостатках этого метода и проблемах его проведения.
1 Ключевым фактором успешности процесса, является, пожалуй, правильный выбор последовательности праймеров. Можно использовать программы, значительно упрощающие поиск подходящих регионов ДНК или даже выбирающие пару праймеров автоматически (например, "Oligo" от molecular Bioligy Insights). Однако ни один из существующих алгоритмов не обеспечивает полной гарантии хорошей работы праймеров. К тому же на самом деле они представляют собой смесь молекул различной длины и состава, что приводит к появлению "минусовых" фракций – молекул с последовательностью, укороченной на одно или несколько оснований, при этом положение пропущенного нуклеотида может быть любым. Поэтому для получения наилучших результатов следует проводить очистку от этих фракций.
2 Следует также обратить внимание на приготовление смеси четырех типов нуклеотидов. Неравная их концентрация ведет к существенному увеличению ошибок ДНК-полимеразы в ходе амплификации. Необходимо также поддерживать соответствующую концентрацию ионов магния, поскольку снижение концентрации свободных катионов влияет на температуру и специфичность гибридизации праймеров.
3 Чрезвычайная чувствительность метода требует строгого соблюдения специального технологического режима, тщательного выполнения всех этапов анализа в отдельных изолированных зонах лаборатории, поскольку существует риск амплификации очень небольших количеств неспецифической ДНК, что приведет к неправильному диагнозу. К тому же ПЦР идеально подходит для получения ответов типа "да-нет", например, присутствует в образце Bacillus anthracis (сибирская язва) или нет. Гораздо меньше этот метод пригоден для определения, какой организм из множества других присутствует в образце. Причина в том, что ПЦР лучше всего работает, когда в тестовой реакции находится только одна или несколько пар праймеров. Если в одной реакции используется большое число пар праймеров, соответсвующих всем возможным возбудителям инфекции, возникает серьезная проблема возможных артефактов.
4 Для правильной интерпретации результатов необходимо также знать, что выявление ДНК возбудителя не всегда говорит о состоянии его жизнеспособности, а также о непосредственной связи выявленного инфекционного агента с конкретным патологическим процессом.
5 Для успешного проведения анализа важно правильно собрать биоматериал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. В настоящее время для забора крови существуют вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести забор материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.
6 Методики, используемые при экстракции нуклеиновых кислот, должны максимально удалять антикоагулянты (например, гепарин) и остатки гема во избежание снижения эффективности амплификации. Системы с протеинкиназами являются более эффективными в сравнении с системами, основанными только на применении химических агентов. Некоторые системы позволяют выделять одновременно вирусные ДНК и РНК, что позволяет унифицировать этапы выделения нуклеиновых кислот при определении в одном образце как ДНК-, так и РНК-содержащих вирусов-мишеней.
7 Следует также иметь в виду, что ДНК-полимеразы, используемые в ПЦР, имеют склонность к ошибкам. Однако основной проблемой применения ПЦР в медицине является существенное ограничение информации о функции генов, участвующих в развитии большинства болезней человека. Сегодня чаще всего известны лишь симптомы этих заболеваний.