Статьи Лабораторная диагностика
|
|
|
|
Пролактин (лабораторная диагностика гиперпролактинемии)
… первым этапом лабораторного обследования лиц обоего пола, страдающих нарушениями репродуктивной функции, по рекомендации ВОЗ является измерение концентрации пролактина в сыворотке (плазме) крови.Пролактин - это гипофизарный гормон, стимулирующий пролиферацию молочной железы и секрецию молока.
Функции пролактина: стимулирует рост и развитие молочных желёз, образование молока (процесс лактации); во время беременности стимулирует выработку прогестерона желтым телом яичников; участвует в выработке гормона тестостерона, стимулирует образование и развитие сперматозоидов (у мужчин); регулирует водно-солевой обмен, задерживая выделение воды и натрия почками; активирует анаболические процессы в организме, стимулирует развитие внутренних органов, сальных желез, регулирует жировой обмен; способствует формированию полового поведения; оказывает модулирующее воздействие на иммунную систему.
Регуляция секреции пролактина. Пролактин синтезируется лактотропными клетками аденогипофиза и секретируется в кровь в очень небольших количествах. Секреция пролактина постоянно тормозится гипоталамическим гормоном дофамином. Дофамин образуется в нейронах паравентрикулярных и серобугорных ядер, а также в нейронах ядра воронки и дугообразного ядра гипоталамуса. Дофамин поступает в воротную систему гипофиза и связывается с дофаминовыми рецепторами на лактотропных клетках. Секреция пролактина усиливается под действием эстрогенов, тиролиберина и нервных импульсов от сосков. Таким образом, физиологическое торможение секреции пролактина зависит от нормальной гипоталамической секреции дофамина, транспорта дофамина в гипофиз по гипоталамо-гипофизарной портальной системе, присутствия дофаминовых рецепторов на лактотрофах гипофиза. Гиперпролактинемия у мужчин и небеременных эутиреоидных женщин отражает нарушение нормального механизма физиологического торможения секреции пролактина.
Хронобиология прлактина. Пролактин секретируется импульсно с частотой от 14 импульсов в сутки в поздней фолликулярной фазе до 9 импульсов в сутки в поздней лютеиновой фазе. Кроме того, существуют суточные колебания секреции пролактина (так, наименьший уровень пролактина наблюдается сразу же после пробуждения). Увеличение секреции пролактина начинается через один час после засыпания и продолжает нарастать в процессе сна. Пик секреции приходится между 5 и 7 часами утра. В целом уровень пролактина в сыворотке крови очень чувствителен к самым разнообразным факторам, способным вызвать транзиторную гиперпролактинемию. Содержание его повышается после еды, после стрессов, таких как гипогликемия и судороги, после полового сношения или энергичной стимуляции сосков. Во время менструального цикла в лютеиновую фазу уровень пролактина несколько выше, чем в фолликулиновую. С 8-й недели беременности уровень пролак¬тина повышается, достигая пика к 20-25 неделе, затем снижается непосредственно перед родами и вновь увеличивается в период лактации.
Биохимия пролактина. Пролактин представляет собой единичную полипептидную цепь и относится к простым белкам. Молекулярная масса составляет около 23 кД. Молекула пролактина имеет 3 внутренних дисульфидных мостика, один из которых связывает далеко отстоящие друг от друга последовательности, а два других формируют маленькие петли около N-конца и С-конца цепи. Около 50-60% полипептидной цепи образуют a-спираль. Пролактин с молекулярной массой 23 кД, или низкомолекулярный пролактин является одной из наиболее распространенных форм гормона, составляет примерно 50-90% общего его количества, обладает высокой биологической активностью. Данной форме принадлежит основная роль в биологическом действии пролактина. Кроме мономерной формы гормона с молекулярной массой 23 кД, в крови имеются его изоформы с различной молекулярной массой; выявлены изоформы пролактина с низкой молекулярной массой - 14, 16, 21, 22 и 25 кД. Отдельно выделяют высокомолекулярные формы пролактина (Big пролактин). Big пролактин имеет молекулярную массу 50-60 кД, находится в форме димера или в комплексе с рецептором, составляет примерно 5-25% общего количества гормона. Big-big, или макропролактин имеет молекулярную массу 150-170 кД, обычно связан с иммуноглобулином G, на его долю приходится в норме 9-21% общего пула пролактина. По данным многих авторов, высокомолекулярные формы пролактина обладают гораздо меньшей биологической активностью и, по-видимому, имеют более низкое сродство к рецепторам.
Концентрация пролактина выражается в нг/мл. Для перевода концентрации в мкМЕ/мл необходимо использовать следующее соотношение: 1 нг/мл = 30,3 мкМЕ/м. Нормальные показатели пролактина сыворотки крови: мужчины 2,5-17 нг/мл (53-360 мкМЕ/л); женщины - фолликулярная фаза 4,5- 33 нг/мл (98-784 мкМЕ/л), середина цикла 6,3-49 нг/мл (134-975 мкМЕ/л), лютеиновая фаза 4,9- 40 нг/мл (104-848 мкМЕ/л).
Диапазон нормы: диапазон нормы для пролактина плазмы равен 1-25 нг/мл для женщин и 1-20 нг/мл для мужчин. При этом очевиден эстроген связанный рост в пубертный период и соответствующее уменьшение в период менопаузы. Уровень пролактина в период беременности увеличивается в десять – двадцать раз от нормального уровня. Концентрация пролактина падает после родов, уменьшаясь до нормального уровня за 3-4 недели. Уменьшение пролактина более медленное у кормящих матерей.
При повышении содержания пролактина свыше 100 нг/мл частота обнаружения опухолей гипофиза пропорциональна степени гиперпролактинемии. Концентрации выше 300 нг/мл являются прямым указанием на пролактиному. Больные с уровнями пролактина от 100 до 300 нг/мл должны быть тщательно обследованы. Даже когда исследование турецкого седла не выявляет опухоли, больные, если их не лечить, нуждаются в длительном наблюдении, так как у большинства из них имеются скрытые микропролактиномы.
Показания к назначению анализа на определение концентрации пролактина: галакторея; цикличные боли в молочной железе; мастопатия; ановуляция; олигоменорея и аменорея; дисфункциональные маточные кровотечения; бесплодие; диагностика полового инфантилизма; дифференциальная диагностика истинного перенашивания беременности; нарушение лактации в послеродовом периоде; тяжело протекающий климакс; ожирение; гирсутизм; снижение либидо и потенции (мужчины); гинекомастия (мужчины); остеопороз; выбор тактики лечения гиперпролактинемических состояний.
Для определения уровня гормона пролактина женщинам можно сдавать кровь на анализ в 1 и 2 фазу менструального цикла. Если нет специальных рекомендаций, кровь сдаётся на 1-3 день менструального цикла. Анализ на пролактин сдается утром натощак, но не ранее чем через 3 часа после пробуждения. За один день до взятия анализа крови на гормон пролактин нужно исключить половые отношения, не посещать сауну, не употреблять алкоголь, избегать стресса (или не сдавать анализ после перенесенного волнения), избегать воздействия на молочные железы. Врачи рекомендуют также не курить в течение часа перед анализом на гормоны и быть в состоянии покоя около 30 минут - отдохнуть и успокоиться перед анализом. Основным лабораторным методом посредством которого определяют концентрацию пролактина в сывортке крови является иммуноферментныц анализ (ИФА), а для определения различных форм гормона применяются такие методики, как гель-фильтрационная хроматография, ультрафильтрация, иммуносепарация и разделение с помощью полиэтиленгликоля.
Определение пролактина методом иммуноферментного анализа (твердофазного). Анализ использует одно анти-пролактин антитело для солиднофазной (микротитрационные ячейки) иммобилизации и другое мышиное моноклональное анти-пролактин антитело в растворе антитело-энзим (пероксидаза хрена) конъюгате. Образцы теста реагируют одновременно с антителами, в результате молекулы протеина будут в сэндвиче солидно-фазными и энзимно-связанными антителами. После 60 минутной инкубации при комнатной температуре, ячейки промываются для удаления несвязанных меченных антител. Добавляется раствор тетраметилбензидина (ТМБ) и инкубируется 20 минут, в результате развивается голубой цвет. Развитие цвета останавливается добавлением стоп раствора, и цвет изменяется на желтый и измеряется спектрофотометрически при 450 нм. Концентрация пролактина прямо пропорциональна интенсивности цвета образца.
Иммуноферментный анализатор иммуноферментного анализа представляет собой планшетный иммуноферментный анализатор со встроенным микропроцессором, обеспечивающим все существующие методики расчета, построение и сохранение калибровочных кривых. Оптическая система прибора состоит из источника света - галогеновой лампыа, четырех интерференционных фильтров и фотодиодов. Благодаря наличию восьми каналов, время обработки одной стандартной планшеты составляет несколько секунд. С целью уменьшения вероятности ошибки из-за возможных различий в геометрии каждой лунки, исследование может проводиться, используя несколько длин волн. Анализатор имеет встроенный шейкер с возможностью выбора нескольких скоростей перемешивания. Энергонезависимая память позволяет сохранять запрограммированные пользователем методики измерений (до 50). Полученные результаты отображаются на жидкокристаллическом дисплее или могутбыть распечатаны на принтере. Посредством порта RS 232, возможно подключение к обычному компьютеру. Встроенные механизмы контроля гарантируют высокую точность проведения исследования. Анализатор является открытой системой для любых методик и реактивов.
Вычисление результатов. Рассчитать средние значения поглощения (А450) для каждого стандарта, контрольных сывороток и образцов. На бумаге для графиков построить калибровочную кривую, откладывая на вертикальной оси (Y) значение поглощения для каждого стандарта против его концентрации в нг/мл на горизонтальной оси (Х). С помощью средних значений поглощения для каждого образца по калибровочной кривой определить соответствующую концентрацию пролактина в нг/мл.
«Золотым стандартом» определения различных форм гормона считается гель-фильтрационная хроматография, которая в настоящее время является наиболее специфичным методом. Однако этот метод дорогостоящий и длительный, что ограничивает его применение в клинической практике. Более быстрыми и дешевыми методами являются ультрафильтрация, иммуносепарация и разделение с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ). Последний метод может быть широко использован в клинических лабораториях, однако не является высокоспецифичным. ПЭГ - материал, используемый в радиоиммунологических методах, способен осаждать высокомолекулярный комплекс с иммуноглобулином G, что позволяет его использовать для определения высокомолекулярного пролактина. Если в сыворотке присутствует высокомолекулярный пролактин, то он осаждается с 12,5% ПЭГ, и таким образом снижается уровень общего пролактина. Определение уровня пролактина в сыворотке до и после ее обработки ПЭГ обычными методами (например хемилюминесценцией) проводится одновременно и, таким образом, определяется уровень общего пролактина. Расчеты проводятся следующим образом: (уровень общего пролактина в мЕД/л после обработки ПЭГ) / уровень общего пролактина в мЕД/л до обработки ПЭГ) х 100%. Если процент извлечения прлактина менее 40%, то принято говорить о преобладании высокомолекулярной формы пролактина, если более 40%, то о преобладании низкомолекулярного пролактина.
Оценка секреции пролактина. Наиболее распространены проба с тиролиберином и проба с блокаторами дофаминовых рецепторов типа 2 (D2). Тиролиберин непосредственно стимулирует лактотропные клетки аденогипофиза, а блокаторы дофаминовых рецепторов типа 2 (например, метоклопрамид) подавляют действие эндогенного дофамина - основного ингибитора секреции пролактина. В норме в любой из этих проб уровень пролактина в сыворотке возрастает как минимум в два раза, причем максимальная концентрация пролактина должна быть 12 нг/мл. У женщин реакция обычно выражена сильнее, чем у мужчин, поскольку секреция пролактина усиливается под влиянием эстрогенов. При гипопитуитаризме базальный уровень пролактина низкий и не повышается под влиянием тиролиберина и других стимулов. Напротив, при изолированных заболеваниях гипоталамуса базальный уровень пролактина высокий, поскольку отсутствует тоническое тормозящее действие дофамина на лактотропные клетки. В таких случаях реакция на тиролиберин и другие стимулы может быть нормальной или ослабленной.
Проба с тиролиберином. Внутривенно вводится 200-500 мкг тиролиберина. У здоровой женщины уровень пролактина повышается вдвое, нормализация происходит через 15 минут. При гиперпролактинемии неопухолевого генеза происходит небольшое повышение концентрации пролактина, при опухоли гипофиза концентрация гормона не меняется. Диагностическая ценность пробы невелика.
Проба с метоклопрамидом (антагонист дофамина). Внутривенно вводится 10 мг метоклопрамида. У здоровой женщины через 1-2 часа концентрация пролактина увеличивается в 7-10 раз. При пролактиноме уровень практически не меняется, при функциональной гиперплролактинемии реакция ослаблена.
Проба с парлоделом. Рецепторный агонист дофамина, действует на уровне гипофизарных лактотрофов, уменьшает секрецию пролактина. Утром натощак принимается 2,5-5 мг парлодела, через 2-4 часа концентрация пролактина резко снижается. При опухоли гипофиза реакция отсутствует, при функциональной гиперпролактинемии - ослаблена.
У женщин с пролактиномами изменение уровней ЛГ (лютеинизирующего гормона) и ФСГ (фолликулостимулирующего гормона) в ответ на введение ЛГ-РГ и реакция ТТГ (тиреотропного горомна) на тиролиберин указывает на интактность гонадотрофов, тиреотрофов и портальной системы гипофиза.