Статьи Лабораторная диагностика
|
|
|
|
Лабораторная диагностика сифилиса
… сифилис характеризуется богатой палитрой манифестных и латентных форм, распознавание которых основывается на комплексном клинико-лабораторном обследовании больного.Материалом для исследования от больных сифилисом служит кровь, отделяемое твердого шанкра, пунктат регионарных лимфатических узлов, ликвор. Выбор материала для исследования и метода микробиологической диагностики определяется стадией патогенеза болезни.
Лабораторная диагностика включает бактериоскопический (в начальной стадии) и серологический методы. Бактериологическое исследование обычно не проводят, так как доступные методы выделения чистой культуры возбудителя не разработаны.
В связи с тем, что возбудитель сифилиса (Treponema pallidum) в отличие от других микроорганизмов плохо культивируется на питательных средах in vitro, а также слабо воспринимает анилиновые красители, все существующие методы ее детекции можно подразделить на прямые и непрямые:
• прямые тесты основаны на непосредственном выявлении возбудителей в очагах поражения; ним относятся: (1) темнопольная микроскопия (в том числе прямой тест на Т. pallidum с флюоресцентными антителами - DFA-TP), (2) RIT (rabbit infektivity test) – заражение материалом от больных кроликов, и (3) ПЦР (пролимеразная цепная реакция - метод, базирующиеся на амплификации нуклеиновых кислот).
• непрямые тесты основаны на выявлении АТ к возбудителю сифилиса в сыворотке крови - серологическая диагностика (лабораторный анализ плазмы каппилярной или венозной крови основанный на иммунологической реакции антиген-антитело (АГ-АТ)), а также редко используемые гистологические исследования.
В свою очередь, все существующие в настоящее время серологические тесты на сифилис подразделяются на две основные группы:
• нетрепонемные: реакция связывания комплемента с кардиолипиновым АГ (РСКк), реакция микропреципитации (РМП), тест быстрых плазменных реагинов - Rapid Plasma Reagins (RPR), Veneral Disease Research Laboratory (VDRL), тест с толуидиновым красным – Toluidin Red Unheated Serum Test (TRUST);
• трепонемные - ракция связывания комплемента с трепонемным АГ (РСКт), реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ или РИТ), реакция иммунофлюоресценции (РИФ) (за рубежом – FTA – Fluorescent Treponemal anibody) с вариантами: РИФ-200 (FTA-200), РИФ-абс (FTA-abs), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) – за рубежом – Treponema pafluidum haemagglutination assay (TPHA), иммуноферментный анализ (ИФА) – за рубежом – Enzymelynked immunosorbent asay (ELISA), иммуноблоттинг (Western Blot).
Темнопольная микроскопия. Прямая визуализация трепонем методом темнопольной микроскопии является убедительным доказательством трепонемной природы заболевания. Наиболее эффективен этот метод при первичном и вторичном сифилисе, наличии поражения кожи и слизистых оболочек. При микроскопии следует дифференцировать Т. pallidum, подвид pallidum, с нитями фибрина, а также с трепонемами нормальной микрофлоры организма человека – Т. refringens и Т. denticola. Т. refringens колонизирует слизистые оболочки наружных половых органов и отличается выраженной подвижностью и отсутствием сгибательных движений. Т. denticola колонизирует слизистую оболочку ротовой полости, ее завитки короче и направлены под более острым углом. Темнопольная микроскопия обладает чувствительностью 74–86% и специфичностью до 97% в зависимости от квалификации исследователя. Чувствительность может снижаться, если повреждение было протерто антисептиком. Вместе с тем отрицательный результат, обусловленный различными факторами, не является основанием для исключения диагноза сифилиса и требует дальнейшего подтверждения методами серологической диагностики. Кроме того, с помощью этого метода невозможно наблюдать за динамикой инфекционного процесса и оценивать эффективность терапии.
Прямой тест на Т. pallidum с флюоресцентными антителами (DFA-TP) использует флюоресцеинконъюгированные АТ для окраски организма в мазках и срезах тканей. DFA-TP не требует подвижных организмов, является более чувствительным и специфичным, но более дорогим и технически сложным, чем темнопольная микроскопия.
На чувствительность обоих микроскопических методов может отрицательно повлиять давность возникновения или состояние повреждения, а также то, получал ли пациент лечение.
Биологический метод диагностики (RIT - заражение материалом от больных кроликов), несмотря на его высокую чувствительность, применяется весьма ограничено из-за таких факторов, как длительность получения результатов и высокая стоимость. Он практически не используется в настоящее время.
К прямым методам определения Т. pallidum по данным ряда зарубежных авторов относятся методы, базирующиеся на амплификации нуклеиновых кислот, такие как ПЦР, которые могут определять наличие всего 10 трепонем в повреждениях, тканях плаценты и других тканях организма. Они существенно улучшили чувствительность и специфичность прямых методов детекции. Множественный ПЦР с одновременным определением Т. pallidum, вируса герпеса типа 2 и Haemophilis ducreyi используется для постановки этиологического диагноза у пациентов с GUD (genital ulcer disease), а также для обоснования алгоритмов синдромного лечения. Поскольку ПЦР-методики для сифилиса коммерчески недоступны, они остаются инструментом исследователей.
(!) Ведущая роль в лабораторной диагностике сифилиса принадлежит серологическим методам исследования, так как Т. pallidum порождает иммунные ответы различного характера. Рассмотрим существующие в настоящее время серологические тесты на сифилис (непрямые тесты).
Нетрепонемные тесты. В нетрепонемных тестах применяется АГ нетрепонемного происхождения (как правило, кардиолипин-лецитин-холестериновый АГ). АТ к фосфолипидным АГ на поверхности трепонем дают перекрестную реакцию с кардиолипиновыми АГ млекопитающих. Флоккуляционные (хлопьеобразующие) методики для обнаружения этих АТ к фосфолипидам были разработаны как неспецифичные скрининговые тесты. К ним относятся РМП и ее модификации: RPR-, VDRL-, TRUST-тест. В данных тестах обнаруживаются IgG- и IgM-АТ к липидам клеточной стенки Т. pallidum, которые появляются в крови примерно через 1 нед. после формирования твердого шанкра. Эти тесты просты, быстры, недороги и обладают превосходной чувствительностью, особенно в ранний период инфекции. Главные недостатки – невозможность использования цельной крови, необходимость ротатора или микроскопа, возможность ложноположительных результатов. У беременных женщин до 28% положительных результатов RPR могут быть биологически ложноположительными. Ложнонегативные результаты могут быть при избытке АТ, что известно как феномен prozone. Перекрестная реактивность может иметь с другими трепонемными инфекциями, включая фрамбезию и пинту.
Нетрепонемные тесты могут быть качественными или полуколичественным. RPR- и VDRL-титры возрастают у пациентов с острой инфекцией, реинфекцией или реактивацией давней инфекции, которая не былa удовлетворительно вылечена. Около 72–84% пациентов с первичным или вторичным сифилисом демонстрируют 4-кратное снижение RPR- и VDRL-титров через 6 мес. после завершения правильного лечения. Скорость серореверсии зависит от титра до лечения и стадии заболевания. Индивиды с первым эпизодом инфекции более склонны к серореверсии, чем индивиды с повторной инфекцией. Поэтому нетрепонемные тесты используются не только для определения активной инфекции, но и для наблюдения за эффективностью лечения.
Трепонемные тесты, такие как РСКт, РИБТ или РИТ, РИФ (за рубежом – FTA и FTA-ABS), РПГА (TPHA или ТРРА), используются для подтверждения позитивных скрининговых тестов, распознавания ложноположительных результатов нетрепонемных тестов, при клиническом, эпидемиологическом и анамнестическом подозрении на сифилис, для диагностики скрытых форм заболевания, установления ретроспективного диагноза пациента. В трепонемных тестах применяются АГ трепонемного происхождения.
РИТ и РИФ обладают более высокой чувствительность (74–94 и 84–99%) и специфичностью (99 и 97% соответственно) и применяются для подтверждения результатов отборочных реакций, распознавания ложноположительных результатов РМП и РСК, а также установления ретроспективного диагноза сифилиса. Недостатками этих методов является техническая сложность, длительность постановки, субъективизм в оценке результатов, высокая стоимость исследования, необходимость высококвалифицированных сотрудников. Следует учитывать также, что, по данным ряда авторов, примерно у 85% адекватно пролеченных больных трепонемные тесты остаются положительными в течение нескольких лет и даже в течение всей жизни, поэтому не могут быть использованы в качестве контроля излеченности. Трепонемные тесты дороги, требуют оборудования и технической подготовки, доступны только в центральных лабораториях.
Иммуноблоттинг предполагался как альтернатива РИФ-абс (FTA-ABS) в качестве подтверждающего теста. Он более чувствителен, чем РИФ-абс (FTA-ABS), но менее чувствителен, чем РПГА (ТРРА). Частота ложноположительных результатов немного меньше в трепонемных тестах, чем в нетрепонемных.
Трепонемные тесты обычно не используются для скрининга, поскольку они не так чувствительны, как нетрепонемные, в первые 2–3 нед. первичной стадии сифилиса. Трепонемные АТ часто персистируют в течение жизни, делая эти тесты менее применимыми в качестве подтверждающих в областях с высокой распространенностью заболевания; они также неприменимы для наблюдения за эффективностью лечения.
В последние годы в отечественную практику лабораторной диагностики сифилиса внедряются стандартизированные высокоинформативные методы серодиагностики – ИФА и РПГА. Принцип ИФА заключается в соединении комплекса АГ-АТ с конъюгатом, содержащим ферментную метку, выявляемую с субстратной смеси. РПГА применяется для выявления специфических АТ к T. pallidum в сыворотке крови: при соединении АГ T. pallidum со специфическими АТ в реакции на микропланшете наблюдается феномен агглютинации эритроцитов. Плюсами данных методов является то, что тест-системы для ИФА и РПГА сертифицированы и регулярно контролируются соответствующими организациями. Из-за простоты постановки, возможности автоматического учета и быстроты получения результатов при исследовании огромного количества проб ИФА и РПГА могут использоваться как в качестве отборочных, так и подтверждающих реакций, поскольку превосходят по чувствительности, специфичности, воспроизводимости КСР и не уступают РИТ и РИФ. Но, следует отметить, что ИФА, как и другие реакции на сифилис, могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Первые могут возникнуть за счет ревматоидного фактора (представляющего собой IgG человека) перекрестно реагирующего с трепонемными АГ; за счет АТ, образующихся при различных системных заболеваниях или индуцированных лекарственными препаратами, наркотиками, нарушениями обмена; у новорожденных – путем образования в организме плода или ребенка IgМ-АТ к IgG матери, что значительно осложняет интерпретацию результатов и установление диагноза врожденного сифилиса. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены наряду с техническими ошибками конкуренцией между IgМ и IgG, поскольку последний обладает большим аффинитетом. Отрицательной стороной РПГА служит то, что данный тест не может быть использован в качестве критерия излеченности заболевания, так как негативация таких реакций, как правило, затруднена, более того, они могут оставаться положительными в течение всей жизни.
Недостатки серодиагностики сифилиса послужили толчком к разработке молекулярно-генетических методов диагностики сифилиса, получивших широкое распространение в последние годы. Запатентованы способы ПЦР-диагностики сифилиса (метод определения специфицеских последовательностей ДНК T. pallidum, заключающийся в амплификации ДНК). Однако несмотря на целый ряд преимуществ ПЦР-диагностики, эти методы обладают и существенными недостатками, среди которых необходимо отметить их высокую стоимость, обусловленную дороговизной праймеров для ПЦР-диагностики и высокой стоимостью лабораторного оборудования, что ограничивает применение этих методов в лабораторной практике.
В настоящее время разрабатываются новые диагностические методы, основанные на выявлении молекулярных маркеров органных поражений при сифилисе методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС). Привлечение в арсенал методов лабораторной диагностики сифилиса ГХ-МС позволяет с высокой степенью достоверности определить наличие T. pallidum в организме по наличию специфического молекулярного маркера. В соответствии с данными исследованиями было показано, что биохимический состав сыворотки крови больных сифилисом отличается от сыворотки здоровых доноров. В сыворотке крови больных сифилисом присутствуют липидные, углеводные и аминокислотные компоненты, которые могут служить молекулярными маркерами присутствия T. pallidum в организме (К.А.Осман, 2004). Также методом ГХ-МС были установлены химические соединения, являющиеся молекулярными маркерами органных поражений на ранних стадиях заболевания. По данным исследования К.А. Осман (2004 г.), такими соединениями при поражении ЦНС являются D-галактоза, D-трентол, глюкоза и ее циклический изомер – инозитол, при поражении печени – ароматические производные жирных кислот (фенилпропионовая и фенилуксусная кислота), аминокислотные фрагменты, липидно-белковый комплекс, при поражении костей – летучие жирные кислоты, липополисахариды и их субъединицы (С18-С20). Таким образом, привлечение в диагностический арсенал методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии позволяет с высокой степенью достоверности определить наличие поражения органов и систем при отсутствии положительных серологических реакций и выраженных клинических проявлений болезни.