Статьи Лабораторная диагностика
|
|
|
|
Лабораторная диагностика Mycoplasma genitalium
… на сегодняшний момент Mycoplasma genitalium является одним из наименее изученных возбудителей.Наряду с традиционными возбудителями инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), такими как сифилис, гонорея, трихомониаз, хламидиоз, в половых путях мужчин и женщин часто обнаруживаются микоплазмы. Среди них особый интерес вызывает Mycoplasma genitalium. Источником заражения является человек, болеющий острой или хронической формой заболевания с манифестным или бессимптомным течением. Распространение в организме происходит каналикулярно, трансплацентарно, лимфогенно, гематогенно, а также при участии сперматозоидов. Дебют заболевания, как правило, связан с началом половой жизни или сменой полового партнера. Для детей основными путями заражения являются анте- и интранатальный. В ранние сроки беременности возможно инфицирование плодного яйца, что нередко приводит к прерыванию беременности. После формирования плаценты заражение плода встречается редко, так как полноценная плацента надежно защищает от инфекции. Микоплазменная инфекция не имеет патогномоничных симптомов. У мужчин M. genitalium вызывает поражение мочеиспускательного канала – уретрит, который может сопровождаться баланитом или баланопоститом, в свою очередь длительное течение балантита может оказаться причиной формирования фимоза, а баланопостита - парафимоза. Обсуждается вопрос о причастности M. genitalium к развитию эпидидимита и простатита, но четких данных на данный момент не получено. По топографии поражений, вызванных M. genitalium у женщин, можно выделить заболевания нижних отделов урогенитального тракта - эндоцервицит и воспалительные заболевания органов малого таза, которые являются результатом восходящей инфекции из шейки матки, приводящей к развитию эндометрита, сальпингита, оофорита, тубоовариального абсцесса и пельвиоперитонита. По мнению ряда авторов, достоверных различий клиническая картина у пациенток с поражениями, вызванными M. genitalium и Chlamydia trachomatis, не различается. Обсуждается вопрос об участии M. genitalium в развитии реактивных артритов. Таким образом, учитывая отсутствие патогномоничных (специфических) признаков микроплазменной (Mycoplasma genitalium) инфекции крайне важным (для назначения специфического лечения) является выявление конкретного возбудителя, который определяет развитие патологических процессов в структурах урогенитальной области. Рассмотрим принципы лабораторной диагностики M. genitalium.
M. genitalium - самая маленькая из известных в настоящее время бактерий, ее геном составляет 580 kbp. Впервые M. genitalium была выделена в культуре в 1981 г., при этом доказательства роста в виде изменения цвета среды появились только через 50 дней. Впоследствии предпринимались неоднократные попытки выделить и размножить другие изоляты из урогенитального тракта, однако до сих пор количество полученных штаммов исчисляется лишь единицами. M. genitalium - исключительно требовательный к условиям культивирования микроорганизм, и поэтому культуральный метод является очень трудоемким и длительным. Несмотря на то, что техника культивирования M. genitalium значительно улучшилась за последние годы, в том числе за счет использования клеточных культур, выделение и размножение этого микроорганизма до сих пор занимает от нескольких недель до нескольких месяцев. M. genitalium и ее ближайший родственник M. pneumoniae имеют целый ряд общих структурных особенностей, значительное антигенное сходство между этими двумя видами микоплазм служит серьезным препятствием для диагностической серологии. Уже в 1982 г., на самых ранних этапах изучения M. genitalium, была продемонстрирована значительная перекрестная реактивность между M. genitalium и M. pneumoniae в реакциях связывания комплемента, ингибирования метаболизма и непрямой гемагглютинации. При этом перекрестные реакции наблюдались как с антисыворотками от кроликов, иммунизированных M. genitalium и M. pneumoniae, так и с сыворотками от пациентов, инфицированных M. pneumoniae. Методология выявления специфических анти-M. genitalium антител постоянно совершенствовалась, и в эпидемиологических исследованиях показана информативность нескольких методов, однако ни один из предложенных тестов к настоящему времени не рекомендован для использования с целью диагностики. Таким образом, из-за неспособности традиционных бактериологических методов диагностики, таких как культуральный и серологический, обеспечить адекватную идентификацию M. genitalium, предположения об этиологической роли этого микроорганизма в развитии воспалительных заболеваний урогенитального тракта оставались недоказуемыми до разработки первых тестов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Результаты первых исследований с использованием ПЦР для выявления M. genitalium у мужчин с негонококковым уретритом были опубликованы в 1993 г. В дальнейшем применение метода ПЦР позволило получить доказательства того, что M. genitalium - это возбудитель, передаваемый половым путем, способный индуцировать ряд заболеваний репродуктивного тракта как у мужчин, так и у женщин. Спектр этих заболеваний аналогичен спектру заболеваний, вызываемых двумя другими возбудителями ИППП - Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae, и включает уретрит, цервицит, эндометрит, воспалительные заболевания органов малого таза.С момента разработки первых ПЦР-тестов для выявления ДНК M. genitalium в литературе были описаны еще около 10 ПЦР-диагностикумов. В большинстве этих ПЦР-систем в качестве мишеней используются консервативные регионы гена адгезии MgPa. Фрагменты гена 16S рРНК также применяются как мишени, однако высокая степень гомологии этих генов у M. genitalium и M. pneumoniae, а также обилие свойственных гену 16S рРНК вторичных структур крайне затрудняют поиск эффективной и специфичной комбинации праймеров. В 2002 г. было опубликовано первое исследование, в котором для анализа ДНК M. genitalium был применен метод ПЦР в реальном времени. Данная технология позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации непосредственно в процессе реакции, в режиме реального времени, что существенно сокращает время анализа и снижает риск контаминации. Кроме того, методология ПЦР в реальном времени позволяет проводить количественную оценку исследуемой мишени в пробе. Возможности применения количественного подхода в диагностике инфекции, вызванной M. genitalium, были продемонстрированы при оценке эффективности терапии. Важные с клинической точки зрения данные с использованием количественной ПЦР в реальном времени были также получены J. Jensen и соавт. (2004): анализ проб мочи и соскобов из уретры мужчин позволил выявить, что 28% уретральных проб содержали ДНК M. genitalium в количестве, не превышающем 10 копий генома на реакцию. Таким образом, поскольку количество возбудителя в урогенитальном тракте может быть очень малым, для обеспечения адекватной чувствительности тесты на M. genitalium должны обладать очень низким пределом обнаружения. Сочетание высокой чувствительности метода ПЦР в реальном времени с высокой специфичностью, обеспечиваемой использованием зонда, позволяет предполагать, что в будущем он станет основным методом диагностики инфекций, вызванных M. genitalium.
В качестве альтернативы ПЦР для выявления M. genitalium недавно был предложен тест на основе метода транскрипционно-опосредованной амплификации (Transcription-Mediated Amplification, TMA; Gen-Probe, San Diego, CA). Мишенью в этом тесте является рибосомная РНК - молекула, присутствующая в количестве нескольких тысяч копий на одну клетку, что обеспечивает высокую чувствительность метода. К тому же автоматизация большинства этапов технологии TMA позволяет одновременно проводить анализ большого числа проб. Как правило, для выявления различных патогенов урогенитального тракта, таких как C. trachomatis и N. gonorrhoeae, используются соскобы из цервикального канала и уретры. Показано, что диагностика ИППП с использованием образцов, полученных неинвазивным путем (моча и вагинальные пробы), является по меньшей мере такой же чувствительной, как и с использованием цервикальных и уретральных проб. К тому же неинвазивный способ получения материала предпочитается пациентами, что значительно облегчает проведение скрининговых обследований. J. Jensen и соавт. (2003) показали, что с использованием проб мочи от мужчин было выявлено больше случаев инфицирования M. genitalium (как и C. trachomatis), чем с использованием соскобов из уретры, что, впрочем, могло быть обусловлено различиями в объеме данных типов материала. У женщин процент выявления инфекции повышался при одновременном анализе мочи и соскобов из цервикального канала. Выбор клинического материала для диагностики M. genitalium также может зависеть от метода подготовки проб, используемого в лаборатории. Таким образом, в настоящее время методы амплификации нуклеиновых кислот являются единственным инструментом обнаружения M. genitalium. До сих пор не предложено ни одного коммерческого теста для обнаружения возбудителя, однако обнадеживающие результаты были получены с использованием тестов, разработанных для исследовательских целей, и весьма вероятно, что в обозримом будущем один или несколько из них будут реализованы в коммерческих тестах для выявления M. genitalium. Однако уже сейчас необходимо, чтобы перед внедрением так называемых in-house («домашних») ПЦР-диагностикумов в обычную лабораторную практику проводилась их полноценная проверка, которая включает оценку аналитической чувствительности и специфичности, а также анализ диагностических характеристик на достаточно большом количестве клинических образцов. Кроме того, лаборатории, предоставляющие услуги по выявлению M. genitalium, должны активно участвовать в программах внешнего контроля качества.