ТЕМА 20 ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ АКТИВИРОВАННЫХ ФАГОЦИТОВ

Фагоцитоз сопряжен с серией метаболических реакций, включая утилизацию глюкозы в цикле Эмбдена-Mейергофа и активацию гексо-монофосфатного шунта, что ведет к потреблению клеткой кислорода с превращением его в высокотоксичные радикалы: супероксиданион-радикал, перекись водорода, гидроксил-радикал, синглентный кислород.

При нарушении оксилительного стресса фагоциты не способны к образованию интермедиатов кислорода, вследствие этого организм больного особенно чувствителен к тем микроорганизмам, которые имеют ферменты, обладающие антирадикальными свойствами. Это золотистый стафилококк, кишечная палочка, хромобактерии, Cerratia, Candida, Aspergillus, содержащие каталазу. Этот фагоцитарный дефект может существовать в нескольких вариантах. Повышенная чувствительность организма к бактериям возможна при недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глютатионпероксидазы или миелопероксидазы, которые участвуют в обеспечении электронами мембранного фрагмента НАДФН-оксидазы. Выявлена корреляция между степенью активации НАДФН-оксидазы и выраженностью оксилительного стресса активированных клеток (P. Mayer, 1984). Единственный физиологический донор электронов для активации молекулярного кислорода в клетках при фагоцитозе - НАДФН-оксидаза (M. Nakatura, 1981). Известно, что активированные фагоциты способны образовывать в 20-30 раз больше радикалов кислорода, чем неактивированные клетки (D. Bass, 1983).

Кислородзависимый механизм киллинга играет ведущую роль в защите против инфекций, вызванных микроорганизмами, что показано в эксперименте (T. Kaul, 1981). Этот механизм отчетливо показан на примере перекиси водорода (дезинфицирующее средство). Tак же отчетливо показана роль ферментов супероксид-дисмутазы и каталазы в нейтрализации токсического действия кислорода, перекиси

водорода и радикалов супероксида на облигатные анаэробные микроорганизмы (Y. Morris, 1976).

Глюкокортикоиды значительно угнетают образование супероксида за счет ингибирования мембранной НАДФН-оксидазы фагоцитов (R. Pelleqini, 1982; Т. Бумагина, Е. Шмелев, 1981).

Завершенность фагоцитоза в конечном счете зависит от образования этими клетками супероксианионрадикала, перекиси водорода, гидроксильного радикала и синглентного кислорода. Именно нарушения в процессе образования этих соединений становятся основной причиной утраты резистентности к бактериальной инфекции при хронической гранулематозной болезни (А. Анненков, 1983).

Повышенный интерес к оксилительному стрессу связан и с другими причинами. Установлено, что антителозависимая цитотоксичность фагоцитов зависит и обусловлена также метаболизмом кислорода.

Вместе с тем образующиеся радикалы кислорода могут оказывать повреждающее действие не только на микроорганизмы, но и на собственные клетки и ткани. Известно, что в развитии проницаемости слизистой оболочки кишечника при ишемии принимают участие многие факторы - гистамин, простагландины, лизосомальные ферменты и бактериальные токсины. Но тем не менее предварительное введение антигистаминных препаратов, индометацина и метилпреднизолона, блокирующего эффект этих веществ, существенно не влияет на предотвращение сосудистой проницаемости и, следовательно, на развитие воспалительной реакции при ишемии, тогда как введение супероксидисмутазы или диметилсульфоксида значительно подавляет развитие сосудистой проницаемости (D. Parks, 1982). Полагают, что токсический эффект радикалов кислорода может быть следствием деградации гиалуроновой кислоты, коллагена базальных мембран и экстрацеллюлярного матрикса (K. Brawn, 1980).

При аутоиммунных заболеваниях (например, ревматоидный артрит) в синовиальной жидкости обнаружено большое количество активированных нейтрофилов, выделяющих многочисленные медиаторы воспаления. Предполагают, что in vivo токсическому эффекту супероксида и перекиси водорода может способствовать низкое содержание в синовиальной жидкости супероксидисмутазы, каталазы, глютатионпероксидазы, в результате чего гиалуроновая кислота разрушается под действием радикалов кислорода (D. Blake, 1983, Greenwald, 1980).

Таким образом, окислительный стресс, характерный для активированных фагоцитов, способствует разрушению фагоцитированного объекта. Этот процесс происходит при контакте фагоцита с объектом,

превосходящим его по размерам (опухолевой клеткой, трансплантатом), причем оксиданты в этом случае выделяются во внешнюю среду. Tак фагоцит осуществляет свою киллерную функцию. Это универсальный эффекторный механизм фагоцитоза. Кроме того, получая сигнал от лимфоцита с помощью антител, взаимодействующих с Fc- рецепторами фагоцита, он осуществляет антителозависимую цитотоксичность. Агрегированный антиген вызывает при взаимодействии с рецепторами фагоцита оксидативный взрыв, а продукты ограниченного протеолиза IgG - хемотаксис фагоцита.

РОЛЬ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ОРГАНИЗМЕ

В последние три десятилетия накоплена большая информация о механизмах возникновения свечения живых клеток и тканей. Совершенствование техники регистрации слабых световых потоков позволяет обнаруживать все более тонкие изменения в функциональном состоянии клеток, оценивать межклеточные взаимодействия. Перспективным представляется применение хемилюминесцентных методов в иммунологии, в частности с целью разработки методов диагностики непереносимости лекарственных средств.

Образование свободных радикалов в организме при восстановлении молекулярного кислорода сопровождается свечением, получившим название «собственная хемилюминесценция». В качестве таких свободных радикалов, имеющих неспаренный электрон на внешней молекулярной орбитали, в живых тканях выступают активные формы кислорода: О-синглентный кислород, О-супероксидный анион-радикал, НО-гидроперекисный радикал, НО-пероксид водорода, С1о-ги- похлорит. Последний радикал образуется из перекиси водорода и иона хлора в присутствии фермента миелопероксидазы. По биологическому действию гипохлорит - активная форма хлора, так как он атакует аминогруппы с образованием хлорамина. В литературе подробно изложены стадии образования и превращений активных форм кислорода (АФК), а также их взаимодействие с органическими молекулами. В настоящее время считают общепризнанным, что радикалы с их огромной реакционной способностью и кратковременностью жизни - важные участники клеточного метаболизма. Mеханизм бактерицидного действия клеток-фагоцитов обеспечен свободными радикалами кислорода. Существуют специализированные ферментные системы

синтеза свободно-радикальных соединений, такие как НАДФН-оксидаза, продуцирующая супероксидный радикал. Другая специализированная система синтезирует окись азота, тоже играющий роль в деятельности фагоцитов. Открыты и подробно описаны ферментные системы, контролирующие уровень свободно-радикальных процессов в живых организмах и защищающие клетки от повреждающего действия свободных радикалов (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза). Существуют и неферментные антирадикальные соединения (витамины А, С, Е и т.п.), регулирующие образование АФК в клетках.

Низкая интенсивность свечения клеток, связанная со свободно-радикальными процессами в последних, обусловливает использование для измерения хемилюминесценции специальные зонды - люминол, люцигенин. Люминол (3-аминофталевый гидразид) - активатор хемилюминесценции. Если в изучаемой системе присутствует диоксид или гидроксильный радикал, люминол вступает в химическое взаимодействие с радикалами -НО и -О с образованием в конечном счете 3-аминофталата в возбужденном электронном состоянии. Переход последнего в основное состояние сопровождается испусканием кванта света. Добавление люминола усиливает свечение в 100 раз. Такую хемилюминесценцию клеток в присутствии люминола называют активированной люминолзависимой хемилюминесценцией (ЛХЛ). Различают хемилюминесценцию, связанную с гипохлоритом (не зависит от супероксиддисмутазы), и хемилюминесценцию за счет активных форм кислорода, зависящую от супероксиддисмутазы. Люминолзависимая хемилюминесценция ингибируется преимущественно азидом натрия, а собственная ХЛ лейкоцитов ингибируется и азидом, и супероксиддисмутазой. Это указывает на то, что люминолзависимая ХЛ в основном определяется миелопероксидазными реакциями. Показано, что наиболее яркая ХЛ стимулированных клеток в присутствии люминола возникает, когда в системе появляются одновременно С1п и Н₂О₂. В этом случае интенсивность вспышки становится на два порядка выше, чем суммарная ХЛ в растворах Clo и Н₂О₂ по отдельности. С этими свойствами люминола связано его применение для изучения процессов, протекающих в фагоцитирующих клетках.

Локализация ХЛ может быть как внутриклеточной (например, при фагоцитозе неопсонизированного латекса), так и внеклеточной (например, при рецепторном взаимодействии с хемотаксическими пептидами). Внутриклеточная ХЛ связана с содержащими миелопероксидазу везикулами. В зависимости от отношения к наличию ионов Са выделяют два механизма генерации ХЛ лейкоцитами:

•  зависимый от увеличения содержания ионов кальция внутри клетки и продуцирующий активные формы кислорода за пределы клетки;

•  независимый от увеличения содержания ионов кальция в клетке и продуцирующий активные формы кислорода внутрь лизосом.

Применив оригинальный хемилюминесцентный метод, позволяющий дифференцировать внутриклеточное и внеклеточное образование радикала -О фагоцитирующими клетками, оказалось, что высокая фагоцитарная активность не всегда коррелирует с повышенной генерацией АФК, в то время как бактерицидная активность клеток тесно связана с количеством внутрифагосомных активных форм кислорода.

Со свойствами люминола усиливать свечение в присутствии гидроксильных радикалов или ионов гипохлорита связано его применение для изучения процессов, протекающих в суспензии фагоцитов, выделяющих гипохлорит.

Как уже было упомянуто выше, к защитным системам от повреждающего действия радикалов кислорода относят антиоксидантные ферменты, способные удалять -Н и -О. Это осуществляется двумя классами ферментов:

•  каталаза, активность которой подавляется азидом натрия;

•  пероксидазы, разрушающие нерадикальным путем с образованием -НО, при этом окисляется не второй радикал -НО, как в случае каталазы, а другие субстраты: НО + АН + пероксидаза >2 НО + А.

СТИМУЛИРОВАННАЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ КЛЕТОК

Воздействие на клетки внешних стимулов запускает каскад внутриклеточных процессов, который заканчивается, с одной стороны, активацией окисления глюкозы через глюкозомонофосфатный шунт (ГМШ) и, следовательно, увеличением содержания НАДФН в клетках, а с другой стороны - активацией мембранного ферментного комплекса: НАДФН-оксидазы. Резкое усиление потребности кислорода клетками-фагоцитами при их стимулировании называют оксидативным взрывом. Оксидативный взрыв включает взаимосвязанные процессы: усиленное окисление глюкозы через ГMШ, снижение отношения НАДФН/НАД+ и отношения восстановленного глутатиона к окисленному, образование в клетках АФК, эмиссию квантов света, т.е. хемилюминесценцию. Интенсивность последней коррелирует с

окислением глюкозы в ГМШ. Широкое применение хемилюминесцентного метода в медикобиологических исследованиях связано с тем, что генерация АФК, регистрируемая с помощью хемилюминесценции, хорошо коррелирует с функциональной активностью фагоцитов. С другой стороны, чем выше интенсивность хемилюминесценции, тем выше и бактерицидная активность фагоцитов.

Итак, запуск оксидативного взрыва, регистрируемого с помощью хемилюминесцентного метода, начинается со взаимодействия фагоцитирующей клетки с различными внешними агентами-стимулами. Последние могут действовать непосредственно на липидный слой мембран клетки, на рецепторы, включенные в нее, или, проникая в клетку, изменять активность внутриклеточных ферментов.

Различают следующие виды стимулов.

•  Неспецифические стимулы, включающие различные воздействия непосредственно на клеточную мембрану. Так, ионофор Л-23187 образует жирорастворимые комплексы с СА и переносит эти ионы в клетку. Частицы кремнезема и короткие импульсы электрического поля воздействуют на клеточную мембрану, вызывая образование в последней микропор. Через микропоры в клетку поступают ионы Сa, становящиеся причиной запуска оксидативного взрыва. Применяют в качестве неспецифических стимулов различные токсины липополисахаридной природы, растворы жирных кислот, липосом, гипохлорит. Итак, общим для большинства неспецифических стимулов в воздействии на клетку следует считать изменение проницаемости мембран и вхождение в клетку ионов Сa.

•  Рецепторные стимулы. Клетки крови гранулоциты, моноциты, лимфоциты, тромбоциты обладают рецепторным аппаратом к большому количеству соединений. Наиболее изучены рецепторы к факторам комплемента С3в, С5а, Fс-фрагменту иммуноглобулинов, гистаминовые Н1- и Н2-рецепторы и др. В литературе представлены работы, посвященные изучению изменения хемилюминесценции фагоцитов при воздействии растворимыми и нерастворимыми иммунными комплексами, компонентами комплемента, фактором активации тромбоцитов. Исследование активации хемилюминесценции в результате рецепторных воздействий представляет особый интерес в изучении механизмов специфической непереносимости лекарственных препаратов.

• Mетаболические стимулы активируют клетки, минуя рецепторный путь взаимодействия и специфически активируя соответствующие реакции на пострецепторном этапе стимуляции клетки. К таким стимулам относят форболовые эфиры (их действие осуществляется через протеинкиназу С, участвующую во внутриклеточных процессах в стимулированных клетках). Сюда же относят арахидоновую кислоту и лейкотриены. Действие лейкотриенов направлено на увеличение активности НАДФН-оксидазы, а арахидоновая кислота входит в каскад внутриклеточных процессов в стимулированных клетках.

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ КЛЕТОК

ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

В литературе накоплено достаточное количество материалов о хемилюминесценции различных типов клеток периферической крови. Общепризнан тот факт, что наиболее яркой интенсивностью хемилюминесценции обладают гранулоциты. Наибольшее количество исследований посвящено изучению ХЛ нейтрофилов при активировании их различными стимулами в присутствии хелмилюминесцентных зондов. Mеханизмы хемилюминесценции фагоцитов зависят от природы стимулирующих агентов, отличаясь известной специфичностью. Tак, люминолзависимая хемилюминесценция нейтрофилов, активированных растворимыми иммунными комплексами, обусловлена ферментативным окислением арахидоновой кислоты. При взаимодействии с нерастворимыми комплексами реакция зависит от НАДФН-оксидазы, а арахидоновая кислота служит мишенью для свободных радикалов кислорода, усиливающих ее ферментативную трансформацию. Эозинофилы при стимуляции их ФMЛФ тоже обладают ЛХЛ. С помощью различных стимулов изучали ХЛ моноцитов. В качестве стимулов использовали опсонизированные бактерии, дрожжевые клетки, зимозан и др. Во всех случаях интенсивность свечения моноцитов была в среднем в 3 раза ниже, чем ХЛ такого же количества гранулоцитов. Зарегистрирована ХЛ стимулированных тромбоцитов. В качестве стимула в этом случае использовали арахидоновую кислоту, тромбин и НПВС.

Единичные сообщения о регистрации хемилюминесценции лимфоцитов и их субпопуляций противоречат данным большинства авторов об отсутствии хемилюминесценции этих клеток и объясняются

примесью гранулоцитов и моноцитов в суспензии. При стимулировании тромбоцитов тромбином активируется фосфолипаза А2, высвобождающая из фосфолипидов арахидоновую кислоту. Под влиянием циклооксигеназы из арахидоновой кислоты образуются нестабильные эндоперекиси простагландинов и тромбоксан А2. Конечным продуктом разрушения этих соединений становятся малоновый диальдегид и тромбоксан В2. Рост интенсивности стимулированной хемилюминесценции тромбоцитов коррелирует с накоплением малонового диальдегида и гидроперекисей в клетках. Таким образом, хемилюминесценция тромбоцитов при действии тромбина возникает в результате включения циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в клетках.

Таким образом, среди клеток периферической крови наиболее выраженной хемилюминесценцией обладают фагоцитирующие клетки, особенно нейтрофилы. Это связано с биологической ролью этой популяции клеток в организме. В частности, бактерицидность нейтрофилов, в основе которой лежит генерация активных форм кислорода, обеспечивает защиту от чужеродных агентов, а также утилизацию собственных белковых структур и клеток, утративших свои свойства.

А.Н. Маянский с соавт. в обзоре, посвященном хемилюмилюминесценции в системе фагоцитоза, приводит схему, наглядно иллюстрирующую участие различных ферментных систем в генерации АФК. Однако манипуляции, связанные с выделением нейтрофилов на градиенте плотности, центрифугирование, отмывание клеток сопровождаются изменением их физико-химических свойств, поэтому более физиологично изучение изменений в генерации АФК гранулоцитами при различных патологических состояниях в условиях, максимально приближенных к естественным, т.е. в цельной крови. В литературе существуют убедительные доказательства, что за люминолзависимую хемилюминесценцию цельной крови отвечают в основном нейтрофилы. Вклад в хемилюминесценцию других клеток (эозинофилов, тромбоцитов, моноцитов) столь незначителен в этих условиях, что им можно пренебречь. Преимущества регистрации изменений хемилюминесценции нейтрофилов в цельной крови заключается еще и в том, что появляется возможность учитывать комплекс межклеточных взаимодействий и гуморальных факторов. Это позволяет использовать ХАЛ-метод для изучения как псевдоаллергических, так и истинно иммунологических механизмов непереносимости лекарственных препаратов.

Взаимодействие чужеродных частиц с поверхностью фагоцита вызывает его активацию, выражающуюся в перестройке метаболизма клетки: происходит увеличение ионной проницаемости клеточной мембраны, усиливается окисление глюкозы и резко (в десятки раз) возрастает потребление кислорода, сопровождающееся образованием диоксида. Это и есть уже упоминавшийся выше оксидативный взрыв. В его основе лежит резкое повышение образования НАДФН в клетке в результате активации гексозомонофосфатного шунта и окисления НАДФН ферментным комплексом НАДФН-оксидазой. Последняя - мембраносвязанный фермент, восстанавливающий молекулярный кислород до супероксидного радикала на внешней поверхности плазматической мембраны за счет окисления НАДФН на его внутренней стороне.

При стимулировании нейтрофилов взвешенными частицами их активация сопровождается образованием фагосом, с которыми сливаются первичные (азурофильные) гранулы, содержащие миелопероксидазу, и вторичные (или специфические) гранулы, содержащие лизоцим и лактоферрин, а также третичные гранулы, содержащие лизосомальные ферменты. В образовавшихся фаголизосомах происходит окончательное переваривание фагоцитированных частиц. Однако фагоцитоз и активация клеток не всегда сопряжены. Воздействие форбол-миристат-ацетатом (ФMA), лектин-конковалином-А и другими стимулами может вызывать активацию клетки, не сопряженную с фагоцитозом. Эти вещества способны модифицировать белки, липиды и нуклеиновые кислоты. Mодификация белков вызывает появление в них антигенных свойств.

В литературе существуют данные о том, что основную роль в повышении выхода ферментов, ассоциированных с гранулами нейтрофилов, играет особый клеточный протеин - кальмодулин, связывающий кальций и регулирующий его участие в различных реакциях стимулированных нейтрофилов. Среди функций нейтрофилов необходимо отметить активное участие этих клеток в формировании иммунологической реактивности организма.

РОЛЬ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В АКТИВАЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ

Ионы кальция - вторичные мессенджеры, регулирующие работу многих биохимических клеточных систем. В состоянии покоя концентрация ионов кальция в нейтрофиле составляет около 100 нм, а при активации клетки различными агентами возрастает более чем в 10 раз.

Стимуляция гранулоцитов с помощью электрического пробоя приводит к возникновению сквозной цилиндрической поры. Образование поры зависит от приложенного напряжения, а ее развитие - от продолжительности импульса. Радиус поры зависит от амплитуды электрического импульса и его длительности. В момент образования радиус составляет примерно 8,4 нм, а через 200 мс уменьшается до 0,5 нм. Таким образом, при активации нейтрофилов электрическими импульсами через образующиеся в мембране поры в клетку проникают крупные молекулы, в том числе и ионы кальция. Электрический пробой при оптимально избранных режимах воздействия бывает обратимым. Так, после электрического пробоя 2 кв/см билипидная мембрана восстанавливается в течение нескольких миллисекунд. Аналогичный механизм активации гранулоцитов выявлен и при стимулировании клеток взвесью кварцевого песка с диаметром частиц 1 мкм.

Итак, в результате образования пор на плазматической мембране в клетку поступают ионы кальция. Основная их мишень - кальмодулин, регулирующий функции ряда ферментов, участвующих в реализации оксидативного взрыва. Увеличение концентрации ионов кальция может также вызвать активацию протеинкиназы, обладающей высокой каталитической активностью. При этом изменяется взаимодействие между компонентами оксидазной системы, приводящее к транслокации их в плазматическую мембрану. В конечном итоге происходит увеличение активности НАДФН-оксидаз.