ГЛАВА 6 БИОТЕХНОЛОГИЯ, ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.1. Биотехнология

Биотехнология является наукой, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности живых организмов, главным образом микроорганизмов, животных и растительных клеток, использует эти биологические процессы, а также сами биологические объекты для промышленного производства продуктов, необходимых для жизни человека или воспроизводства биоэффектов, не проявляющихся в естественных условиях (А.А. Воробьев).

6.1.1. Объекты биотехнологии, ее цели и задачи

Биотехнология (от греч. bios - жизнь, tecen - искусство, logos - наука) представляет собой область знаний, которая возникла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генной инженерии, иммунологии, химической технологии и ряда других наук. Рождение биотехнологии обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для народного хозяйства, в том числе для медицины и ветеринарии, а также принципиально новых технологиях. Целью биотехнологии являются получение продуктов из биологических объектов или с их применением, а также воспроизводство биоэффектов, не встречающихся в природе. В качестве биологических объектов чаще всего используются одноклеточные микроорганизмы, животные и растительные клетки, а также организм животных, человека или растений. Выбор этих объектов обусловлен следующими причинами.

Клетки являются своего рода биофабриками, вырабатывающими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты: белки, жиры, углеводы, витамины, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и т.д. Многие

из этих продуктов, крайне необходимых в жизни человека, пока недоступны для получения небиотехнологическими способами.

Клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Так, бактериальная клетка делится через каждые 20-60 мин, дрожжевая - через 1,5-2 ч, животная - через 24 ч, что позволяет за относительно короткое время искусственно нарастить на сравнительно дешевых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток.

Биосинтез сложных веществ, таких, как белки, антибиотики, антигены, антитела, значительно экономичнее и технологически доступнее, чем другие виды химического синтеза. При этом исходное сырье для биосинтеза, как правило, проще, дешевле и доступнее, чем сырье для других видов синтеза. Для этого используются отходы сельскохозяйственной, рыбной продукции, пищевой промышленности, растительное сырье, например рыбная мука, меласса, дрожжи, древесина и др.

Биотехнология использует следующие продукты одноклеточных:

•  сами клетки как источник целевого продукта;

•  крупные молекулы, которые синтезируются клетками в процессе выращивания, - ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.;

•  первичные метаболиты - низкомолекулярные вещества (мол. масса менее 1500 Д), необходимые для роста клеток - аминокислоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты и др.;

•  вторичные метаболиты (идиолиты) - низкомолекулярные и макромолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток, - антибиотики, алкалоиды, токсины, гормоны и др.

Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате технологической обработки превращается в конечный, пригодный для использования продукт.

Помимо микроорганизмов, животных и растительных клеток, биотехнология в качестве биологических объектов использует органы и ткани человека и животных, растения, организм животных и человека. Например, для получения инсулина используется поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней, гормона роста - гипофизы трупов человека, иммуноглобулинов - организм лошадей и других животных, препаратов крови - кровь доноров и т.д.

Биотехнология, используя перечисленные выше биологические объекты, получает огромный ассортимент продукции, применяемой в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой и химической промышленности, других отраслях народного хозяйства. К ним относятся продукты, без которых немыслимо существование современного человека: антибиотики, витамины, ферменты, вакцины, гормоны, аминокислоты, нуклеотиды, комплемент и препараты крови, иммуномодуляторы, антитела, диагностические препараты, сердечно-сосудистые, противоопухолевые и множество других фармацевтических препаратов, пищевые и кормовые белки, биологические средства защиты растений, инсектициды, сахара, спирты, липиды, дрожжи, кислоты, бутанол, ацетон и др.

Помимо этого биотехнология играет большую роль в оздоровлении окружающей среды: с помощью биотехнологических процессов проводят очистку от загрязняющих веществ почвы, водоемов, воздушной среды путем их биоконверсии и биодеградации.

Однако биотехнология не ограничивается получением только вышеперечисленных продуктов. Значительные, более масштабные и революционные проблемы она решает на пути создания трансгенных животных и растений, т.е. создания новых, ранее неизвестных пород животных и растений, а также клонирования животных. Новейший раздел биотехнологии - генная и белковая инженерия - позволяет получать совершенно уникальные биотехнологические эффекты, открывать способы диагностики, профилактики и лечения врожденных болезней, влиять на свойства генома человека, животных и растений.

6.1.2. История развития биотехнологии

Старая биотехнология возникла в древности, примерно 6000- 5000 лет до н.э., тогда, когда люди научились выпекать хлеб, варить пиво, приготовлять сыр и вино. Этот первый этап биотехнологии был сугубо эмпирический и продолжал оставаться таким, несмотря на совершенствование технологических процессов и расширение сфер использования биотехнологических приемов, вплоть до открытия Л. Пастером в XIX в. ферментативной природы брожения. С этого момента начался второй, научный, этап традиционной биотехнологии. В этот период получены и выделены

ферменты, открыты многие микроорганизмы, разработаны способы их выращивания и получения в массовых количествах, получены культуры животных и растительных клеток и разработаны способы искусственного культивирования, в результате изучения физиологии, биохимии и генетики микробных и животных клеток намечены пути получения многих продуктов микробного синтеза, необходимых для медицины, сельского хозяйства и промышленности. Вначале сформировалась техническая микробиология, а затем - биотехнология. Однако промышленное производство сводилось в основном к получению на основе природных штаммов биомассы бактерий, дрожжей, грибов, вирусов, из которых затем получали или выделяли необходимый продукт (ферменты, антибиотики, антигены, белок и т.д.).

На смену старой, традиционной биотехнологии пришла новая биотехнология, основанная на применении искусственно получаемых штаммов-суперпродуцентов бактерий, клеток животных и растений, использовании иммобилизованных ферментов, применении культур животных и растительных клеток, широком использовании генно-инженерных работ для получения клетокрекомбинантов, моноклональных антител и других биологически активных веществ.

Рождение новой биотехнологии обусловлено рядом принципиальных открытий и достижений в науке: доказательство двунитевой структуры ДНК, расшифровка генетического кода и доказательство его универсальности для человека, животных, растений, бактерий и т.д., искусственный синтез биологически активных веществ, открытие ферментов обмена нуклеиновых кислот, получение рекомбинантных ДНК, а также рекомбинантных вирусов, бактерий, способных синтезировать несвойственные им продукты, искусственный синтез генов и их экспрессия в биологических объектах, получение трансгенных животных и растений, генодиагностика и генотерапия и др.

Вышеупомянутые фундаментальные достижения позволили в течение последнего десятилетия расшифровать, синтезировать и создать рекомбинантные молекулы для целого ряда белковых продуктов (гормонов, антигенов, ферментов, иммунных препаратов) и получать их в несвойственных биологических системах.

6.1.3. Микроорганизмы и процессы, применяемые в биотехнологии

На Земле существует около 100 тыс. видов бактерий, не считая многочисленных грибов (250 тыс. видов), вирусов, простейших. Микробы способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, полезные для биотехнологии. Однако в практике используют не более 100 видов микроорганизмов, так как остальные мало изучены.

Так, например, дрожжи используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток.

Из бактерий в биотехнологии чаще всего используют род Acetobacter - для превращение этанола в уксусную кислоту, углекислый газ и воду; род Bacillus - для получения ферментов (B. subtilis), средств защиты растений (B. thuringiensis); род Clostridium - для сбраживания Сахаров в ацетон, этанол, бутанол; молочнокислые бактерии (Lactobacillus и др.); псевдомонады, например РР. denitrificans, - для получения витамина В₁₂; Corynebacterium gentamicum - для получения аминокислот и др.

Из грибов в биотехнологии для получения разнообразных антибиотиков применяют род Streptomyces, Penicilium chrysogenium, Cefalosporum acremonium, Streptomyces spp. и др.

Естественно, широкое применение в получении диагностикумов, вакцин, иммуноглобулинов, пробиотиков, фагов и других микробных препаратов находят патогенные и вакцинные штаммы болезнетворных микробов, а также условно-патогенные микроорганизмы.

Многие микроорганизмы - бактерии, дрожжи, вирусы - используются в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов - продуцентов биотехнологической продукции. Так получены рекомбинантные штаммы E. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормоны роста, разнообразные антигены; штаммы B. subtilis, вырабатывающие интерферон; дрожжи, продуцирующие интерлейкины, антигены вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены вируса гепатита В, вируса клещевого энцефалита, ВИЧ и др.

6.2. Генетическая инженерия и область ее применения в биотехнологии

Генетическая инженерия является сердцевиной биотехнологии. Она по существу сводится к генетической рекомбинации, т.е. обмену генами между двумя хромосомами, которая приводит к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации in vitro или генетической инженерии заключается в выделении или синтезе ДНК из отличающихся друг от друга организмов или клеток, получении гибридных молекул ДНК, введении рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки, создании условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами.

Гены, кодирующие те или иные структуры, или выделяют (клонируют) как таковые (хромосомы, плазмиды), или прицельно выщепляют из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции. Эти ферменты, а их уже известно более тысячи, способны резать ДНК по многим определенным связям, что является важным инструментом генной инженерии.

В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК, наподобие рестриктаз ДНК. Эти ферменты названы рибозимами.

Сравнительно небольшие гены могут быть получены с помощью химического синтеза. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества, а затем по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, поскольку каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). С помощью синтезатора создают химическим путем ген, аналогичный природному гену.

Полученный одним из способов целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качестве вектора, для встраивания гибридного гена в клетку. Вектором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений.

Экспрессируемый ген в виде рекомбинатной ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или животную клетку, которая приобретает новое свойство - продуцировать несвойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном.

В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют E. coli, B. subtilis, псевдомонады, нетифоидные серовары сальмонелл, дрожжи, вирусы.

Методом генной инженерии созданы сотни препаратов медицинского и ветеринарного назначения, получены рекомбинантные штаммы-суперпродуценты, многие из которых нашли практическое применение. Уже используются в медицине полученные методом генной инженерии вакцины против гепатита В, интерлейкины-1, 2, 3, 6, инсулин, гормоны роста, интерфероны α, β, γ, фактор некроза опухолей, пептиды тимуса, миелопептиды, тканевый активатор плазминогена, эритропоэтин, антигены ВИЧ, фактор свертывания крови, моноклональные антитела и многие антигены для диагностических целей.

Задания для самоподготовки (самоконтроля) (к главам 5, 6)

A. Назовите процесс, в котором принимает участие бактериофаг:

1. Конъюгация.

2. Трансформация.

3. Трансдукция.

4. Репарация.

Б. Назовите свойства плазмиды, необходимые для осуществления передачи хромосомы путем конъюгации:

1. Интегративность.

2. Гипермутабельность.

3. Трансмиссивность.

4. Суперспирализованность.

B. Назовите структуры, которые участвуют в распространении генов в популяции бактерий:

1. Плазмиды.

2. Интегрон.

3. Транспозон.

4. Репликон.

Г. Назовите ферменты, которые применяются в генной инженерии:

1. Рестриктазы.

2. Лигазы.

3. Протеазы.

4. ДНК-полимераза.

Д. При санитарно-бактериологическом контроле продукции молочного завода из образцов сметаны был высеян возбудитель дизентерии Shigella flexneri. Сразу же была проведена проверка сотрудников этого завода на бактерионосительство, во время которой от сотрудника К. был выделен возбудитель того же вида и серовара. Назовите метод, который можно использовать для внутривидовой идентификации выделенных культур, позволивший бы подтвердить или опровергнуть тот факт, что сотрудник К. явился источником заражения продукции.