РАЗДЕЛ 7. ОБМЕН ХРОМОПРОТЕИНОВ И НУКЛЕОПРОТЕИНОВ. БИОХИМИЯ КРОВИ И МОЧИ. БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ

РАЗДЕЛ 7. ОБМЕН ХРОМОПРОТЕИНОВ И НУКЛЕОПРОТЕИНОВ. БИОХИМИЯ КРОВИ И МОЧИ. БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ

ВВЕДЕНИЕ

В обмене сложных (конъюгированных) белков особый интерес представляют синтез и распад небелкового компонента, так как превращения белковой части молекулы происходят аналогично простым белкам (см. раздел 6). Углеводные, липидные и неорганические компоненты подвергаются обычным превращениям в процессе обмена веществ.

Часть сложных белков организма содержит в своем составе гем (гемоглобин, миоглобин, цитохромы, гемсодержащие ферменты). При распаде гема образуется билирубин, который является малорастворимым, токсичным соединением. Током крови билирубин доставляется в печень и там конъюгирует с глюкуроновой кислотой - таким образом повышается его растворимость и снижается токсичность. Под влиянием различных факторов может нарушаться образование и выведение билирубина и продуктов его метаболизма из организма. Повышение содержания билирубина в крови ведет к отложению его в тканях, вызывая их окрашивание в желтый цвет (желтуха).

Небелковая часть нуклеопротеинов распадается на соответствующие нуклеотиды под действием специфических нуклеаз. Конечным продуктом распада пуриновых нуклеотидов у человека является мочевая кислота, которая удаляется из организма главным образом с мочой. Повышение концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови за счет нарушения обмена или поступления в организм значительных количеств пищи, содержащей нуклеопротеины, на фоне снижения рН ведет к отложению натриевых солей мочевой кислоты (уратов) в мягких тканях и суставах, как следствие развивается подагра.

В этом разделе предлагается провести определение концентрации общего билирубина в сыворотке крови, а также содержания мочевой кислоты в моче.

Доступность крови и мочи для исследований делают биохимический анализ этих объектов чрезвычайно значимыми для врачей-клиницистов как в процессе постановки диагноза, так и для дальнейшей оценки состояния пациентов и, что не менее важно, оценки эффективности проводимой терапии.

Кровью ко всем тканям организма доставляются кислород и различные питательные вещества, поступающие извне. Конечные про- дукты обмена веществ выводятся с мочой. Изменение химических процессов в организме приводит к изменению состава крови и мочи: в одних случаях - к дисбалансу химических веществ, присутствующих в норме, в других - к появлению в исследуемых объектах соединений, отсутствующих в норме.

Для оценки некоторых показателей крови и мочи можно использовать экспресс-тесты (тестовые полоски), которые позволяют оп- ределить рН и полуколичественно оценить содержание глюкозы, ацетоновых (кетоновых) тел, белка, билирубина и некоторых других диагностически важных соединений.

Особое значение имеет изучение ферментного состава крови и мочи. Понижение или повышение активности так называемых диа- гностически значимых ферментов, а также появление ферментов, отсутствующих в норме, служат объективным диагностическим критерием патологических изменений.

Именно поэтому в разделе представлены практические работы, в которых предлагается оценить активность ферментов амилазы, лактатдегидрогеназы и холинэстеразы с тем, чтобы составить представ- ление о методах энзимодиагностики. В каждой работе приведены нормальные значения соответствующих величин, а также указаны возможные причины отклонения показателей от нормы.

7.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Билирубин - промежуточный продукт распада гема и основной желчный пигмент человека. Образование большей части били- рубина (около 85%) происходит при распаде гемоглобина эритроцитов, а остальные 15% билирубина образуются при распаде гема миоглоглобина, цитохромов, каталазы, пероксидазы и других гемопротеинов.

Различают две формы билирубина:

1) свободный (неконъюгированный, непрямой) билирубин токсичен (особенно для мозга), плохо растворим в воде и связывается сывороточным альбумином (транспортная форма в крови);

2) связанный (конъюгированный, прямой) билирубин образуется в печени конъюгацией с УДФ-глюкуроновой кислотой. В результате образуется нетоксичный, хорошо растворимый в воде диглюкуронид билирубина, выводимый из организма.

Суммарно обе эти формы определяют как общий билирубин.

Определение в клинике содержания билирубина в крови (непрямого, прямого, общего), а также уробилиногена в моче используют для дифференциальной диагностики желтух различной этиологии.

Цель работы

Определить концентрацию общего билирубина в сыворотке крови и сравнить полученный результат с нормой.

Принцип метода

Общий билирубин определяют реакцией с диазотированной сульфаниловой кислотой после диссоциации свободного билирубина в присутствии кофеинового реагента. В результате реакции образуется азосоединение розового цвета, которое после добавления щелочного буфера меняет окраску на зеленую. Контроль не содержит нитрита натрия, необходимого для диазотирования сульфаниловой кислоты. Оптическая плотность растворов, измеренная при 578 нм, пропорциональна содержанию билирубина в пробе.

Выполнение работы (см. Приложение 9.2)

?

Реактивы и этапы

Опыт

Контроль

1

Сульфаниловая кислота, мл

0,2

0,2

2

Раствор нитрита натрия, мл

0,05

-

3

Кофеиновый реагент , мл

1,0

1,0

4

Сыворотка , мл

0,2

0,2

5

Тщательно перемешивают и инкубируют 20 мин при комнатной температуре

6

Щелочной буфер , мл 1,0 1,0

Окончание табл.

Самостоятельное формулирование выводов

Тестовые задания по теме «Синтез и распад гема»

I. Определите, верно ли утверждение.

1. Амидный азот глутамина может использоваться для синтеза гема.

2. Синтез гема происходит в цитоплазме клеток.

3. Ацетил-КоА необходим для синтеза гема.

4. Прямой билирубин - это моноили диглюкуронид билирубина.

5. Непрямой билирубин входит в состав желчных камней.

6. Железо для синтеза гема запасается в ферритине.

7. Биосинтез гема регулируется по типу обратной связи.

8. δ-Аминолевулинатсинтаза является аллостерическим ферментом.

9. Стеркобилиноген образуется в печени. 10. Билирубин имеет окраску.

II. Глицин нужен для биосинтеза гема. 12. Биливердин выводится с мочой.

2. Выберите правильный ответ.

Продукты распада гема - это Коферментом

1) желчные кислоты δ -аминолевулинатсинтазы

2) желчные пигменты является

3) протопорфирины 1) ФАД

4) уропорфирины 2) НАД+

5) все вышеперечисленные 3) ПФ соединения 4) ТПФ

5) тетрагидробиоптерин

3. Установите соответствие между процессом и участвующим в нем метаболитом.

7.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ

Мочевая кислота является конечным продуктом катаболизма аденозина и гуанозина (пуринового обмена). Выводится из организма почками с мочой и в меньшей степени через желудочно-кишечный тракт. Будучи слабой кислотой, мочевая кислота присутствует в биологических жидкостях как в недиссоциированной форме, так и в виде мононатриевой соли. Плохо растворима в воде.

Роль мочевой кислоты в патологии связана с ее низкой растворимостью. Мочевая кислота осаждается в виде кристаллов урата натрия. Отложение этих кристаллов в суставах вызывает подагру. Мочевая кислота может откладываться в почках в виде камней.

Гиперурекемия наблюдается при обильном потреблении пищи, содержащей нуклеотиды; при усиленном синтезе пуриновых нуклеотидов; при врожденных нарушениях резервных «путей спасения» аденина и гипоксантина [синдром Леша-Найана (Lesch-Nyhan Syndrome)] и большей частью вследствие нарушения почечной экскреции с мочой.

Цель работы

Определить суточное выделение мочевой кислоты с мочой и сравнить полученный результат с нормой.

Принцип метода

Метод основан на способности мочевой кислоты восстанавливать в щелочной среде бесцветный фосфорно-вольфрамовый реактив в соединение синего цвета. При титровании этого соединения раствором красной кровяной соли K3[Fe(CN)6] раствор обесцвечивается. Израсходованное количество красной кровяной соли соответствует количеству мочевой кислоты.

Выполнение работы (см. Приложение 9.2)

К 2,5 мл свежевзятой мочи прибавляют 1 мл 30%-ного раствора NaOH и 1 мл фосфорно-вольфрамового реактива. Раствор приобре- тает синее окрашивание.

Затем раствор титруют щелочным раствором красной кровяной соли (0,0015М) до обесцвечивания. Отмечают объем красной кровяной соли, израсходованной на титрование (л).

Расчеты

Количество мочевой кислоты в 2,5 мл мочи составляет 0,0015 ? V (моль), в 1 л - 0,0015 ? 400 ? V = 0,6 ? V(моль/л). Зная относительную молекулярную массу мочевой кислоты (Mr = 168), рассчитывают ее массу в 1 л:

m = 0,6 ? V ? 168 = 100,8 ? V (г).

Считая суточный диурез равным 1,5 л, получают величину суточной экскреции мочевой кислоты с мочой:

100,8 ? V ? 1,5 = 151,2 ? V (г/сут).

Конечная формула расчета:

экскреция мочевой кислоты = 0,0015 ? V? 400 ? 168 ? 1,5 (г/сут),

где 0,0015 - концентрация K3[Fe(CN)6], моль/л;

V - объем K3[Fe(CN)6], израсходованный на титрование, л;

168 - молярная масса мочевой кислоты, г/моль;

1,5 - суточный диурез мочи, л;

400 - коэффициент пересчета 2,5 мл пробы на 1 л.

Норма: 0,3-0,9 г/сут (1,7-5,1 ммоль/сут). Самостоятельное формулирование выводов

Тестовые задания по теме «Распад и синтез нуклеотидов»

1. Определите, верно ли утверждение.

1. Азотистые основания пищи используются для биосинтеза нуклеиновых кислот нашего организма.

2. Источником NH2-группы при синтезе ГМФ из инозиновой кислоты является глутаминовая кислота.

3. Конечный продукт распада аденозина у человека - мочевая кислота.

4. Концентрация мочевой кислоты в крови человека в норме составляет 0,2 г/ л.

5. Регуляция синтеза пиримидиновых оснований осуществляется по типу отрицательной обратной связи.

6. Азот пиримидиновых оснований выводится из организма в основ-

ном в виде мочевой кислоты.

7. Аспарагин участвует в биосинтезе пуринового кольца.

8. ЦМФ может образоваться из УМФ.

9. β-Аланин - конечный продукт катаболизма ТМФ в организме человека.

10. Карбамоилфосфат участвует в синтезе пиримидиновых нуклеотидов.

11. Ингибитор ксантиноксидазы применяют для лечения подагры.

12. В восстановлении рибозы до дезоксирибозы участвует только тиоредоксин.

2. Выберите правильный ответ.

Источником NH2-группы Конечный продукт катаболизма

при синтезе АМФ ТМФ в организме человека - это из инозиновой кислоты является 1) мочевая кислота

1) мочевина 2) β-аминоизомасляная

2) аспарагиновая кислота кислота

3) аспарагин 3) инозиновая кислота

4) карбамоилфосфат 4) креатин

5) ион аммония 5) β-аланин

3. Установите соответствие между X и Yв цепи превращений

7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ α-АМИЛАЗЫ В МОЧЕ. КОМПОНЕНТЫ МОЧИ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

А. Определение активности α-амилазы в моче

α-Амилаза (КФ: 3.2.1.1) - фермент, катализирующий гидролитическое расщепление 1,4-а-гликозидных связей в молекулах крахмала и гликогена.

В организме человека основными источниками α-амилазы являются поджелудочная железа и слюнные железы, в которых существует два семейства изоферментов амилазы - P и S.

Изоферменты P образуются только в поджелудочной железе, изоферменты S - преимущественно в слюнных железах, а также в других органах и тканях. Доля изоферментов P в общей активности а-ами- лазы значительно выше в моче, чем в сыворотке крови.

Резкое (в 10-30 раз) повышение активности α-амилазы в сыворотке крови и в моче наблюдается при остром панкреатите (в первые сутки).

Цель работы

Определить активность α-амилазы в моче и сравнить полученный результат с нормой.

Принцип метода

Существует много разных методов определения активности α- амилазы. Мы познакомимся с простым и надежным методом после- довательных разведений фермента, предложенным еще в 1929 г. Вольгемутом и сохранившимся до настоящего времени. Метод основан на определении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала (отсутствие цветной реакции с йодом) при заданных условиях.

Выполнение работы

Получение последовательных разведений мочи: в шесть пробирок наливают по 1 мл 0,85%-ного раствора NaCl. В первую пробирку вносят 1 мл мочи и тщательно перемешивают. 1 мл смеси из первой пробирки переносят во вторую, перемешивают. 1 мл из второй пробирки переносят в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки после перемешивания 1 мл выливают в раковину.

В результате получают ряд последовательных разведений мочи (1:2; 1:4; 1:8 и т. д.). Во все пробирки быстро вносят по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляют по 1 капле 1%-ного раствора йода и тщательно перемешивают. Результаты окраски растворов в пробирках заносят в таблицу.

Пробирка

1

2

3

4

5

6

Разведение

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

Окраска с йодом

 

 

 

 

 

 

Отмечают последнюю пробирку, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание с йодом), и рассчитывают активность α-амилазы.

Расчеты

За условную единицу активности (ед. Вольгемута) принимают активность, необходимую для расщепления 1 мл 0,1%-ного раствора крахмала при комнатной температуре за 30 мин:

А = 2*Р (ед. Вольгемута),

где 2 - объем 0,1%-ного раствора крахмала, мл;

Р - разведение (см. таблицу), например, 1-я пробирка - разведение 2, 6-я пробирка - разведение 64.

Норма: от 16 до 64 усл. ед. Вольгемута.

Самостоятельное формулирование выводов

Б. Компоненты мочи в норме и при патологии

Для обеспечения нормальной жизнедеятельности химический состав организма должен быть относительно постоянным. Для этого необходимо удаление избытка воды и электролитов, а также продуктов метаболизма. Основным органом, регулирующим состав

водорастворимых химических компонентов организма, являются почки. В составе мочи обнаружено более 150 химических ингредиентов. Следует отметить, что широко используемое понятие «патоло- гические компоненты мочи» в известной мере условно, так как большинство соединений, рассматриваемых как патологические, может, хотя и в небольшом количестве, присутствовать в нормальной моче. Другими словами, речь идет о веществах, которые в моче здорового человека не встречаются в аналитически определяемых количествах. Это прежде всего белки, глюкоза, кетоновые тела, билирубин и гемоглобин.

Для обнаружения этих веществ можно использовать экспресс-методы полуколичественного анализа - так называемые тест-полоски.

Цель работы

Провести экспресс-тесты с пятью образцами мочи. Определить рН каждого из образцов, а также содержание белка, кетоновых тел, глюкозы. Проанализировать полученные результаты.

Принцип метода

О концентрации того или иного реагента можно судить по изменению окраски сенсорной зоны, сопоставив полученный результат с соответствующей цветной шкалой на упаковке.

Сенсорная, или реакционная, зона любой тест-полоски (для определения глюкозы, кетонов, белка, нитритов, билирубина, уробилиногена и т. д.) представляет собой некую матрицу, в которой находится много различных сбалансированных химических компонентов. Наряду с этими компонентами в некоторые сенсорные зоны тест-полосок вводят ферменты, специфически взаимодействующие с определяемым веществом в пробе. Тест-полоски с наличием ферментов в сенсорной зоне называют ферментативными.

Чтобы результаты были корректными, определение необходимо проводить в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией по применению. См. Приложение 9.2.

?

Анализируемое соединение

Рабочий реагент

1

Белок

Эфир тетрабромфенолфталеина, тетрабромфеноловый синий

2

Глюкоза

Глюкозооксидаза, пероксидаза, тетраметилбензидин

3

Кетоновые (ацетоновые) тела

Натрия нитропруссид

4

рН

Метиловый красный, бромтимоловый синий

Примечание. Белок - проба, наиболее чувствительная к альбумину, значительно менее чувствительная к глобулинам, мукопротеинам, гемоглобину и белку Бенс-Джонса. На определение белка не влияет величина рН мочи, но в сильнощелочной моче (рН выше 8) или в моче с высокой буферной емкостью тест может дать ложноположительные результаты. Не обращайте внимания на окраску сухой зоны.

Определение глюкозы основано на ферментативной (глюкозаок- сидаза/пероксидаза) реакции, тест специфичен для глюкозы, другие сахара не взаимодействуют. Реакция не зависит от рН и присутствия кетоновых тел.

Кетоны - проба, значительно более чувствительная к ацетоуксусной кислоте, чем к ацетону. С β-гидроксимасляной кислотой проба не реагирует. Лекарственные и диагностические препараты на основе фенолфталеина или сульфонфталеина, присутствующие в моче, могут в щелочной среде зоны окрашиваться в красный и даже пурпурный цвет. Цветовая шкала сравнения на этикетке отражает концент- рацию ацетоуксусной кислоты в моче.

Предварительно лаборанты готовят пять образцов: один с нормальной мочой, а каждый следующий отличается от нормы по одному из исследуемых показателей.

Выполнение работы

Тест-полоску опускают на 1-2 с в исследуемый образец так, чтобы сенсорные зоны были смочены. Капли мочи с полоски удаляют, проведя полоской по краю сосуда с мочой. Полоску оставляют в горизонтальном положении. Приблизительно через 60 с сопоставляют окраску зон индикации с соответствующей цветовой шкалой и результаты заносят в таблицу.

Анализируемое соединение

Образец I

Образец II

Образец III

Образец IV

Образец V

рН

 

 

 

 

 

Белок

 

 

 

 

 

Глюкоза

 

 

 

 

 

Кетоновые тела

 

 

 

 

 

Самостоятельное формулирование выводов

Тестовые задания по теме «Интеграция обмена основных классов органических соединений. Использование ферментов в медицине»

I. Определите, верно ли утверждение.

1. Анаболические и катаболические процессы чаще всего разобщены

пространственно.

2. Основное количество АТФ для биоситеза белка образуется за счет окислительного фосфорилирования.

3. Печень занимает центральное место в обмене белков, углеводов и липидов.

4. Активность трансаминаз в сыворотке крови в норме значительно выше, чем в тканях.

5. Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови повышается при рахите.

6. Определение активности кислой фосфатазы сыворотки крови специфично для заболеваний предстательной железы.

7. Активность амилазы повышается при панкреатитах.

8. L-аспарагиназу используют для лечения лейкозов.

9. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови является информативным методом.

10. Для диагностики заболеваний печени определяют активность КФК в сыворотке крови.

II. При инфаркте миокарда повышается содержание изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ2.

12. Глюкозоксидазный метод определения глюкозы является специфичным.

2. Выберите правильный ответ.

Синтез АТФ из АДФ в печени При инфаркте миокарда в крови

происходит в основном путем положительны тесты

1) реакции с ГТФ 1) на повышение активности

2) окислительного фосфорили- АсАТ и АлАТ

рования 2) на увеличение содержания

3) субстратного фосфорилиро- ЛДГ1 и ЛДГ2

вания 3) на повышение активности КФК

4) взаимодействия с ФФн 4) на увеличение содержания

5) реакции с ЦТФ МВ-изоформы КФК

5) все перечисленные

3. Установите соответствие между метаболитом и его суточным выделением с мочой в норме.

7.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Холинэстераза - это фермент, который катализирует гидролиз эфиров холина: 

Различают два типа холинэстераз, которые обозначают как истинную холинэстеразу (ацетилхолинэстераза) и псевдохолинэсте- разу (холинэстераза, ХЭ). Истинная холинэстераза (ацетилхолингидролаза, КФ: 3.1.1.7) отличается узкой субстратной специфичностью, гидролизует преимущественно ацетилхолин. Псевдохолинэстераза (ацетилхолин-ацилгидролаза, КФ: 3.1.1.8) обладает более широкой субстратной специфичностью и гидролизует другие эфиры холина.

Истинная холинэстераза локализована в эритроцитах, мышечной и нервной тканях, играет важную роль в передаче нервного импульса путем разрушения ацетилхолина в нервных синапсах и в нервно-мышечном сопряжении.

Псевдохолинэстераза присутствует в сыворотке крови, печени, поджелудочной железе и других внутренних органах.

При заболеваниях и поражениях печени активность холинэстеразы в сыворотке крови снижается, так как нарушается синтез фермента гепатоцитами. Низкий уровень ХЭ может наблюдаться при раковых заболеваниях, острых инфекциях, инфаркте миокарда, беременности, а также у курильщиков.

Активность ХЭ сыворотки крови снижается при отравлениях фосфорорганическими соединениями, инсектицидами, нерв- но-паралитическими газами или другими сходными по химическому строению веществами, которые являются сильными ингибиторами ХЭ.

Повышенный уровень ХЭ может наблюдаться при интенсивных физических тренировках, а также при приеме ряда терапевтических препаратов.

Цель работы

Определить активность фермента холинэстеразы в сыворотке крови и сравнить полученный результат с нормой.

Принцип метода

В ходе реакции, катализируемой холинэстеразой, образуется уксусная кислота, что приводит к снижению рН реакционной среды. Если проводить реакцию в присутствии индикатора (м-нит- рофенола), то при понижении рН наблюдается обесцвечивание раствора, пропорциональное ферментативной активности ХЭ. Для определения фонового оптического поглощения готовят контроль-

ный раствор, в котором холинэстеразную активность сыворотки ингибируют прозерином. При 400 нм измеряют оптическую плотность в контрольной и опытной пробах и их разность используют для вычисле- ния активности ХЭ по калибровочному графику зависимости Dк - Dоп от

активности ХЭ. За единицу активности холинэстеразы (ед.) принимают такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль уксусной кислоты из ацетилхолина за 10 мин

при 25 оС.

Выполнение работы (см. Приложение 9.2)

Маркируют две пробирки и вносят в них последовательно реактивы (перемешивая содержимое пробирок после добавления каждого).

Активность холинэстеразы определяют по калибровочному графику зависимости (Dк -Dоп) от активности ХЭ (данные для построения графика приведены в таблице).

Норма: 40-120 ед. Самостоятельное формулирование выводов

Тестовые задания по теме «Нормальные

и патологические компоненты крови и мочи»

1. Определите, верно ли утверждение.

1. Креатин в норме определяется в сыворотке крови и в моче.

2. Содержание холестерина и мочевины в крови (ммоль/л) сопоставимо с содержанием глюкозы.

3. В сыворотке крови в норме больше пировиноградной кислоты, чем молочной.

4. Содержание глутамина в сыворотке крови (мкмоль/л) сопоставимо с концентрацией аланина.

5. Общий билирубин определяется как в сыворотке крови, так и в моче.

6. Протеинурия может выражаться в появлении в моче альбуминов.

7. При сахарном диабете возможно выведение ацетоновых тел с мочой более 100 г/сут.

8. Фосфатидилхолин является нормальным компонентом сыворотки крови.

9. ЛПВП являются атерогенными.

10. Выведение 10 г/сут хлористого натрия с мочой является нормой.

11. Суточное выведение с мочой мочевины, креатинина и мочевой кислоты - сопоставимые величины.

12. Стеркобилин присутствует в моче.

2. Выберите правильный ответ.

Азот пиримидиновых оснований Патологическими компонентами выводится из организма мочи не являются

в основном в виде 1) белки

1) мочевой кислоты 2) кетоновые тела

2) креатинина 3) глюкоза

3) β-аланина 4) сульфаты

4) мочевины 5) билирубин

5) креатина

3. Установите соответствие между поражением органа и повышением активности фермента в сыворотке крови.

7.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Лактатдегидрогеназа [ЛДГ (L-лактат: НАД-оксидоредуктаза; КФ: 1.1.1.27)] - цитоплазматический цинксодержащий гликолитический фермент, обратимо катализирующий восстановление пировиноградной кислоты в молочную кислоту:

Каждая молекула ЛДГ состоит из четырех субъединиц двух типов: Н (heart) и M (muscle), образующих пять изоферментов: ЛДГ14), ЛДГ2 3М1), ЛДГ3 2М2), ЛДГ4 1М3), ЛДГ5 4).

Наибольшая активность отмечается в почках, печени (ЛДГ4 и ЛДГ5), сердце (ЛДГ1 и ЛДГ2), скелетных мышцах (ЛДГ5), поджелудочной железе, клетках крови. В эритроцитах уровень ЛДГ в 100 раз выше, чем в сыворотке. У детей активность фермента выше, чем у взрослых; с возрастом активность ЛДГ сыворотки крови плавно снижается. Повышенная активность ЛДГ в физиологических условиях наблю- дается у беременных, новорожденных, а также после интенсивных физических нагрузок.

Резкое повышение содержания ЛДГ в сыворотке крови отмечается при заболеваниях печени, инфаркте миокарда и инфаркте легкого. Активность ЛДГ сыворотки крови повышается также при заболеваниях системы крови, злокачественных новообразованиях различных органов, заболеваниях почек (гломерулонефриты, пиелонефриты, инфаркт почки и т. п.), остром панкреатите. Прием алкоголя и некоторых лекарственных средств (кофеин, анестетики, цефалоспорины, нестероидные противовоспалительные средства, сульфаниламиды) также может быть причиной повышения концентрации ЛДГ в сыворотке крови.

Принцип метода

Активность ЛДГ определяют по окислению лактата в пируват. Накапливающийся в реакции НАДН(Н+) в присутствии переносчика электронов восстанавливает краситель йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан, о концентрации которого судят по оптической плотности раствора при 500 нм.

Выполнение работы* (см. Приложение 9.2)

Маркируют четыре пробирки и вносят в них реактивы согласно таблице.

Самостоятельное формулирование выводов

Тестовые задания по теме

«Биосинтез нуклеиновых кислот и белков»

1. Определите, верно ли утверждение.

1. Дезоксинуклеотидтрифосфаты - непосредственные субстраты для синтеза ДНК.

2. Процесс транскрипции может регулироваться трииодтиронином.

* Поскольку наборы для определения ЛДГ очень дороги, проводят одно определение на группу.

3. Непосредственным донором метильной группы при синтезе ТМФ является метенил-ТГФК.

4. Все типы РНК синтезируются в ядре.

5. Биосинтез дочерних цепей ДНК осуществляется в направлении 5'-3'.

6. Оксилизин и оксипролин - продукты посттрансляционной модификации соответствующих аминокислот.

7. Связывание тРНК с аминокислотами обеспечивается аминоацилтРНК-синтетазами.

8. РНК могут проявлять каталитическую активность.

9. Биосинтез РНК на матрице ДНК контролируется стероидными гормонами.

10. Постсинтетическая модификация белков может происходить путем фосфорилирования.

11. Стадии элонгации в биосинтезе белков и нуклеиновых кислот различаются.

12. Модификация белков может осуществляться путем частичного протеолиза.

2. Выберите правильный ответ.

Фермент, синтезирующий Постсинтетическая модификация

аминоацил-тРНК, относят белков может происходить

к классу путем их

1) трансфераз 1) фосфорилирования

2) лиаз 2) гидроксилирования

3) лигаз (синтетаз) 3) ограниченного протеолиза

4) оксидоредуктаз 4) ковалентного связывания

5) изомераз с простетической группой

5) всеми перечисленными способами

3. Установите соответствие между процессом и его локализацией в клетке.

7.6. КОЛЛОКВИУМ ПО ТЕМЕ «ОБМЕН ХРОМОПРОТЕИНОВ И НУКЛЕОПРОТЕИНОВ. БИОХИМИЯ КРОВИ И МОЧИ. БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКА»

Вопросы для самостоятельной подготовки

1. Источники атомов пуринового ядра. Биосинтез аденозинмонофосфата и гуанозинмонофосфата из инозиновой кислоты.

2. Распад пуриновых нуклеотидов. Гиперурикемия и подагра.

3. Основные реакции синтеза пиримидиновых нуклеотидов.

4. Распад пиримидиновых нуклеотидов.

5. Биосинтез нуклеиновых кислот.

6. Биосинтез гема и его распад. Определение прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови.

7. Биосинтез белка. Основные компоненты белоксинтезирующей системы. Посттрансляционная модификация белков.

8. Связь обмена углеводов, липидов и белков.

9. Примеры использования ферментов в медицине.

10. Патологические компоненты мочи.

11. Основные неорганические и азотсодержащие компоненты мочи.

12. Основные химические компоненты сыворотки крови человека.

Варианты письменной части коллоквиума

1. Напишите последовательность реакций

1) биосинтеза гема

2) распада пуриновых нуклеотидов

3) синтеза пиримидиновых нуклеотидов

4) распада гемоглобина

2. Укажите значение количественного определения

1) мочевой кислоты

2) непрямого билирубина

3) креатинфосфокиназы

4) патологических компонентов мочи

3. Составьте схему образования

1) дезоксирибонуклеотидов

2) АТФ

3) ГТФ

4) ТТФ

4. Приведите один конкретный пример использования фермента в целях

1) энзимодиагностики

2) энзимотерапии

3) получения лекарственных препаратов

4) количественного определения метаболитов

5. Составьте схему превращения в глюкозу

1) аланина

2) глицерина

3) пирувата

4) аспартата

6. Укажите, при какой патологии и как изменяется электрофоретическая фракция белков сыворотки крови

1) альбуминов

2) α2-глобулинов

3) β-глобулинов

4) γ-глобулинов

Варианты заданий компьютерного тестирования

Инструкция к тесту. Выберите все правильные ответы.

1. Отсутствующая в составе белков аминокислота - это

1) аспарагиновая кислота

2) аргинин

3) лизин

4) орнитин

5) глицин

2. Повышенный уровень амилазы в моче указывает на заболевания

1) печени

2) сердца

3) легких

4) поджелудочной железы

5) кишечника

3. Синтез АТФ из АДФ в печени происходит в основном путем

1) реакции с ГТФ

2) окислительного фосфорилирования

3) субстратного фосфорилирования

4) взаимодействия с ФФн

5) реакции с ЦТФ

4. Железо в ретикулоцитах регулирует синтез δ-аминолевулинатсинтазы на стадии

1) активации аминокислот

2) инициации трансляции

3) элонгации трансляции

4) терминации трансляции

5) на всех стадиях

5. Азот пиримидиновых оснований выводится из организма в основном в виде

1) мочевой кислоты

2) креатинина

3) β-аланина

4) мочевины

5) креатина

6. Лечение больных подагрой аллопуринолом (ингибитором ксантиноксидазы) вызывает

1) снижение скорости синтеза пуриновых нуклеотидов de novo

2) снижение уровня мочевой кислоты в моче

3) возрастание уровня гипоксантина в крови

4) снижение уровня мочевой кислоты в крови

5) снижение уровня мочевины в моче

7. Активированные аминокислоты соединяются

1) с псевдоуридиловой петлей тРНК

2) с кодоном мРНК

3) с антикодоном тРНК

4) с 3'-ОН-группой рибозы концевого аденозина тРНК

5) с фосфатом на 5'-конце тРНК

8. Постсинтетическая модификация белков может происходить путем их

1) фосфорилирования

2) гидроксилирования

3) ограниченного протеолиза

4) ковалентного связывания с простетической группой

5) метилирования

9. Гем входит в состав

1) амилазы

2) пероксидазы

3) пепсина

4) миоглобина

5) цитохромов

10. К буферным системам крови относят

1) бикарбонатную

2) фосфатную

3) белковую

4) гемоглобиновую

5) трис-глициновую

11. δ-аминолевулиновая кислота синтезируется

1) из сукцинил-КоА и глицина

2) из аспартата и карбамоилфосфата

3) из аспартата и глицина

4) из глутамата и глицина

5) из ацетил-КоА и оксалоацетата

12. Веществами, из которых может образоваться мочевая кислота, являются

1) уридин

2) гуанозин

3) ксантин

4) гипоксантин

5) тимидин

13. Источником ]NН2-группы при синтезе АМФ из инозиновой кислоты является

1) мочевина

2) аспарагиновая кислота

3) аспарагин

4) карбамоилфосфат

5) соль аммония

14. Непосредственными субстратами для синтеза ДНК являются

1) дезоксирибоза, фосфат и азотистые основания

2) фосфат и дезоксирибонуклеозиды

3) дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

4) дезоксирибонуклеозиддифосфаты

5) пуриновые и пиримидиновые основания

15. Конечный продукт катаболизма ТМФ в организме человека - это

1) мочевая кислота

2) β-аминоизомасляная кислота

3) инозиновая кислота

4) креатин

5) β-аланин

16. Аденин входит в состав

1) ФАФС

2) НАД+

3) КоА

4) ПФ

5) биотина

17. Из инозиновой кислоты в организме могут синтезироваться

1) АМФ

2) ГМФ

3) ЦМФ

4) ТМФ

5) УМФ

18. УМФ может входить в состав

1) тРНК

2) мРНК

3) ДНК

4) рРНК

5) митохондриальной ДНК

19. Аминокислота, образующаяся в составе белков в результате их постсинтетической модификации, - это

1) пролин

2) β-аланин

3) глицин

4) 5-гидроксилизин

5) глутамин

20. Отличительными особенностями тРНК является наличие

1) антикодона

2) аденозина на 3'-конце

3) большого количества минорных оснований

4) только дезоксирибонуклеотидов

21. Процесс транскрипции может регулироваться

1) адреналином

2) норадреналином

3) кортизолом

4) вазопрессином

5) окситоцином

22. При инфаркте миокарда в сыворотке крови положительны тесты

1) на повышение активности аминотрансфераз

2) на увеличение содержания ЛДГ1 и ЛДГ2

3) на повышение активности креатинкиназы

4) на увеличение активности амилазы

5) на увеличение активности кислой фосфатазы

23. Патологическими компонентами мочи (в клинических анализах) не считаются

1) белок

2) кетоновые тела

3) глюкоза

4) сульфаты

5) фосфаты

24. Оротовая кислота является промежуточным продуктом синтеза

1) пуриновых нуклеотидов

2) пиримидиновых нуклеотидов

3) гема

4) холестерина

5) кетоновых тел

25. Источником ]NН2-групп при синтезе ГМФ из инозиновой кислоты является

1) аспарагиновая кислота

2) глутамин

3) глутаминовая кислота

4) карбамоилфосфат

5) мочевина

26. Резкое увеличение активности кислой фосфатазы в сыворотке крови указывает на поражение

1) сердца

2) мышц

3) печени

4) поджелудочной железы

5) предстательной железы

27. Непосредственным предшественником образования мочевой кислоты является

1) гипоксантин

2) ксантин

3) аденин

4) гуанин

5) инозиновая кислота

28. Конечным продуктом катаболизма УМФ является

1) мочевая кислота

2) β-аминоизомасляная кислота

3) инозиновая кислота

4) креатин

5) β-аланин

29. δ-аминолевулиновая кислота является промежуточным продуктом синтеза

1) пуринов

2) пиримидинов

3) гема

4) холестерина

5) кетоновых тел

30. Продукты распада гема - это

1) желчные кислоты

2) желчные пигменты

3) протопорфирины

4) уропорфириногены

5) железо

31. Синонимы конъюгированного билирубина

1) свободный

2) связанный

3) прямой

4) непрямой

5) общий

32. Биосинтез РНК на матрице ДНК может контролироваться

1) белковыми факторами транскрипции

2) тиреоидными гормонами

3) стероидными гормонами

4) вазопрессином

5) адреналином

33. Патологический компонент мочи - это

1) мочевина

2) креатинин

3) креатин

4) мочевая кислота

5) хлорид натрия

34. β-Аланин

1) входит в состав белков

2) является конечным продуктом распада уридина

3) является конечным продуктом распада аденозина

4) входит в состав КоА

5) участвует в орнитиновом цикле

35. Наибольшее количество минорных нуклеотидов включается

1) в тРНК

2) в мРНК

3) в рРНК

36. Наибольшее количество атомов включается в пуриновое кольцо из молекулы

1) глутамина

2) аспартата

3) глицина

4) аргинина

5) аспарагина

37. Фермент, синтезирующий аминоацил-тРНК, относят к классу

1) трансфераз

2) лиаз

3) лигаз (синтетаз)

4) оксидоредуктаз

5) изомераз

38. В образовании дезоксирибо-нуклеозиддифосфатов из рибонуклеозиддифосфатов участвует

1) цистеин

2) ацетил-КоА

3) тиоредоксин

4) метионин

5) серин

39. Конечный продукт распада аденозина у человека - это

1) β-аланин

2) ксантин

3) инозиновая кислота

4) мочевая кислота

5) мочевина

40. Железо гемоглобина не связывается

1) с кислородом

2) с оксидом углерода(П)

3) с цианидами

4) с диоксидом углерода

5) с гистидином глобина

41. Аминокислоты, которые встречаются в составе белков, - это

1) пролин

2) орнитин

3) гомоцистеин

4) β-аланин

5) лейцин

42. Прямой билирубин образуется в результате

1) действия на гем гемоксидазы

2) потери гемом атома железа

3) связывания билирубина с глюкуроновой кислотой

4) разрыва порфиринового кольца

5) окисления гема

43. Коферментом β-аминолевулинатсинтазы является

1) ФАД

2) НАД+

3) ПФ

4) тиаминпирофосфат

5) тетрагидробиоптерин

44. Стеркобилиноген синтезируется

1) в печени

2) в почках

3) в кишечнике

4) в крови

5) в поджелудочной железе

45. Появление в моче производных фенола может быть связано с воздействием микрофлоры кишечника на аминокислоту

1) пролин

2) триптофан

3) аргинин

4) тирозин

5) гистидин

46. Для синтеза белка необходимо наличие

1) двадцати различных аминокислот, связанных с тРНК

2) рибосом

3) ГТФ

4) ЦТФ

5) лизосом

47. Углеводы, участвующие в биосинтезе нуклеиновых кислот, образуются

1) в процессе гликолиза

2) в процессе глюконеогенеза

3) в процессе гликогенолиза

4) в цикле Кребса

5) в процессе окисления глюкозы по пентозофосфатному пути

48. Источником рибозы и дезоксирибозы для синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов служат метаболиты

1) гликолиза

2) пентозофосфатного пути окисления глюкозы

3) цикла трикарбоновых кислот

4) глюконеогенеза

49. Превращение рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды осуществляется путем реакции

1) окисления

2) восстановления

3) гидроксилирования

4) дегидратации

5) дегидрирования

50. Конечным продуктом распада пуриновых нуклеозидов у человека является

1) ксантин

2) гипоксантин

3) аллантоин

4) мочевая кислота

5) мочевина

51. Повышение активности щелочной фосфатазы в крови может происходить при заболеваниях

1) мышц

2) печени

3) поджелудочной железы

4) костной ткани

5) предстательной железы

52. Деградация белков в клетках происходит

1) в протеасомах

2) в лизосомах

3) в пероксисомах

4) в ядре

5) в рибосомах

53. Процессы обмена белков, жиров и углеводов в организме человека

1) взаимосвязаны

2) объединены в целостный процесс метаболизма

3) не связаны друг с другом

4) протекают непрерывно

54. Субъединицы рибосом характеризуются

1) массой в граммах

2) размерами в сантиметрах

3) скоростью седиментации в центрифужном поле в единицах Сведберга

55. Функция аминоацил-тРНК-синтетаз - это

1) синтез аминокислот

2) синтез тРНК на матрице ДНК

3) активирование аминокислот и их связывание с тРНК

4) образование пептидных связей между аминокислотами

56. Убиквитин («метка смерти») присоединяется к белкам по аминокислоте

1) лейцину

2) аланину

3) валину

4) лизину

5) глицину

57. Окрашенные соединения - это

1) аденин

2) билирубин

3) гемоглобин

4) порфобилиноген

5) пепсин

58. Синтез пиримидиновых нуклеотидов происходит

1) в ядре

2) в митохондриях

3) в рибосомах

4) в цитоплазме

5) в лизосомах

59. Продуктами ксантиноксидазной реакции могут быть

1) аденин

2) мочевая кислота

3) мочевина

4) пероксид водорода

5) ацетон

60. Кофеин ингибирует

1) аденилатциклазу

2) гуанилатциклазу

3) фосфодиэстеразу

4) протеинкиназу А

5) протеинкиназу С

61. Гиперурекимию наблюдают при

1) подагре

2) гликогенозах

3) фенилпировиноградной олигофрении

4) бери-бери

5) синдроме Леша-Найана

62. Активность α-амилазы в моче можно определить по скорости расщепления

1) сахарозы

2) лактозы

3) крахмала

4) целлюлозы

63. Ферменты, определение активности которых в сыворотке крови используют в диагностических целях, - это

1) амилаза

2) пепсин

3) реннин

4) креатинкиназа

5) ЛДГ

64. Ферменты, используемые в медицине в терапевтических целях, - это

1) пепсин

2) трипсин

3) химотрипсин

4) коллагеназа

5) аспарагиназа

65. Специфическое связывание и транспорт железа осуществляют белки

1) α-глобулины

2) γ-глобулины

3) трансферрины

4) церулоплазмин

5) альбумины

66. Билирубин-глюкуронид образуется

1) в клетках РЭС

2) в гепатоцитах

3) в клетках почек

4) в просвете кишечника

5) в энтероцитах

67. Метаболит ЦТК, используемый для синтеза гема, - это

1) ацетил-КоА

2) цитрат

3)2-оксоглутарат

4) сукцинил-КоА

5) сукцинат

68. Конъюгированный билирубин связан

1) с глюкуроновой кислотой

2) с альбумином

3) с глобулином

4) с фосфатом

5) с глюконовой кислотой

Правильные ответы

1. 4 15. 29. 43. 57. 2, 3

2. 4 16. 1, 2, 3 30. 2, 5 44. 58. 4

3. 2 17. 1, 2 31. 2, 3 45. 59. 2, 4

4. 2 18. 1, 2, 4 32. 1, 2, 3 46. 1, 2, 3 60. 3

5. 4 19. 33. 47. 61. 1, 5

6. 2, 3, 4 20. 1, 2, 3 34. 2, 4 48. 62. 3

7. 4 21. 35. 49. 63. 1, 4, 5

8. 1, 2, 3, 4, 5 22. 1, 2, 3 36. 50. 64. 1, 2, 3, 4, 5

9. 2, 4, 5 23. 4, 5 37. 51. 2, 4 65. 3

10. 1, 2, 3, 4 24. 38. 52. 1, 2 66. 2

11. 1 25. 39. 53. 1, 2, 4 67. 4

12. 2, 3, 4 26. 40. 54. 68. 1

13. 2 27. 41. 1, 5 55. 3

14. 3 28. 42. 56. 4

LUXDETERMINATION 2010-2013