Принципы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Методы культивирования вирусов и бактериофагов.ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Различные инфекции могут проявляться в организме больного в очень сходных симптомах, и в тоже время клиническая картина инфекции, вызванная определенным вирусом, может быть весьма разнообразной по своей симптоматике.
Определить возбудителя, особенно при тяжелых заболеваниях, важно и для прогноза дальнейшего течения болезни, установления ее отличий от неинфекционных заболеваний со сходными симптомами и выбора правильного способа лечения. Быстрая лабораторная диагностика позволяет провести неотложные и правильные противоэпидемические мероприятия и обнаружить источник вирусной инфекции.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
- выделение и идентификацию возбудителя;
- обнаружение и определение титров противовирусных антител;
- обнаружение антигенов вирусов в образцах исследуемого материала;
- микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала. При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
- образцы следует отбирать как можно раньше либо с учетом ритма циркуляции возбудителя;
- материал следует отбирать в объеме, достаточном для всего комплекса исследований;
- образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной - при температуре -50°С.
Выделение и культивирование вирусов
Вирусы размножаются только в живых клетках. В лаборатории их культивируют в
культурах клеток,
куриных эмбрионах или
организмах чувствительных животных.
Для диагностики вирусных заболеваний применяют следующие методы:
- Вирусоcкопический.
- Иммунной электронной микроскопии.
- Вирусологический.
- Серологический.
- Иммунофлюоресцентный.
- Биологический.
- Использование ДНК-(РНК)-зондов.
- Цепная полимеразная реакция.
Рис. 1. Для лабораторной диагностики вирусных инфекций чаще используют серологические методы исследования. Идентификация вирусов
Идентификацию вирусов проводят качественным и количественным определением вирусов, по морфологии вирусов и с помощью серологических методов.
Рис. 2. Герпесвирус (слева), вирус гепатита В (справа) электронная микроскопия.
Рис. 3. Вирус гриппа (слева), вирус иммунодефицита человека (справа) электронная микроскопия. Культивирование вирусов Для выделения и культивирования вирусов используются чувствительные биологические модели: лабораторные животные, развивающиеся куриные эмбрионы (7— 13-дневные) и культуры клеток (первично-трипсипизированные, перевиваемые и полуперевиваемые линии).
Культивирование на животных. Лабораторные животные в настоящее время чаще используются для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, чем для культивирования вирусов. Основными экспериментальными моделями служат следующие животные: белые мыши (при выделении вирусов бешенства, энцефалитов, гриппа и вирусов Коксаки), хорьки (вируса гриппа), кролики (вирусов оспы, бешенства), обезьяны (вируса полиомиелита).
Культивирование в куриных эмбрионах. Большинство вирусов обладает способностью размножаться в курином эмбрионе. Преимуществом этого метода является отсутствие спонтанных вирусных инфекций, а замкнутая полость эмбриона служит надежной защитой от попадания микроорганизмов из окружающей среды. Культивирование в курином эмбрионе применяется при первичном выделении вирусов из патологического материала, а также при необходимости пассировать и сохранять вирусы, получать необходимое количество вирусов— при изготовлении некоторых живых вакцин и диагностических препаратов.
Культивирование в культурах клеток и тканей. Является одним из основных методов выделения и изучения вирусов. С введением в 1948—1952 гг. метода клеточных культур были выделены ранее неизвестные вирусу усовершенствована и упрощена диагностика вирусных заболеваний, улучшено производство вакцин и диагностических препаратов, открыты новые возможности для изучения взаимодействия вируса и клетки. Преимущество метода культивирования вирусов в культуре клеток состоит в том, что почти к каждому вирусу можно подобрать чувствительные клетки или ткани, создать стандартные условия (наличие клеток одного типа).
Для приготовления культур клеток чаще всего используются эмбриональные ткани (человека, различных животных, птиц) и клетки злокачественных образований, отличающиеся более активной способностью к размножению. Применяются и нормальные ткани человека, обезьян и некоторых других видов животных.
В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники культивирования различают несколько типов Культур клеток и тканей:
I. Культуры переживающих эксплантатов тканей.
II. Культуры растущих тканей:
1) культуры фиксированных кусочков ткани;
2) однослойные культуры клеток: а) первично-трипсинизированные (однократно культивируемые); б) перевиваемые клеточные культуры; в) полуперевиваемые культуры клеток (штаммы диплоидных клеток человека и животных).
III. Суспензионные культуры растущих клеток.
Однослойные культуры растущих клеток составляют
основную культуру клеток современной лабораторной и производственной вирусологической практики. Различают два основных вида однослойных культур клеток: первичные и. перевиваемые.
1. Однослойные первично-трипсинизированные, которые получают обработкой исходной ткани трипсином. Эти клетки размножаются только в первых генерациях. Для получения трипсинизированных культур клеток можно использовать любую ткань — эмбриональную (человека, животных или птиц), а также ткань взрослого человека как нормального, так и опухолевого происхождения.
2. Перевиваемые культуры клеток — клетки, обладающие способностью к размножению и перевивкам вне организма при специальных условиях культивирования. Их получают из нормальных и злокачественных тканей; они могут сохраняться в лабораториях десятки лет посредством постоянного пассирования. К настоящему времени получено и применяется свыше 200 линий клеток. Перевиваемые культуры клеток имеют следующие преимущества: 1) работа по их получению менее трудоемка по сравнению с приготовлением первичных культур клеток и дешевле; 2) клетки имеют одинаковую форму и стабильны в своих свойствах.
При культивировании вирусов в культуре клеток подбирается наиболее чувствительная к данному вирусу ткань, на которой возможно его активное размножение.
В зависимости от свойств вируса и типа зараженных им клеток исходом взаимодействия вируса с клеткой могут быть следующие изменения культур клеток.
Цитопатический эффект (ЦПЭ) — развитие дегенеративных процессов в клетках (рис. 20). Эти изменения связаны с нарушением метаболизма в клетках и являются строго специфическими для проявления жизнедеятельности каждого вида вируса, отличающимися характером изменений. Наблюдать ЦПЭ можно под малым увеличением микроскопа, поместив пробирку со слоем клеток и а предметный столик. Например, вирусы полиомиелита вызывают мелкозернистую деструкцию клеток, нарушают связи между клетками, которые приобретают округлую форму. Аденовирусы, размножаясь в клетках, превращают их в мелкие округлые скопления, напоминающие виноградные гроздья.
Образование симпластов — гигантских многоядерных клеток в результате слияния цитоплазмы нескольких клеток и амитотического деления. Такие изменения вызывает вирус PC (респираторно-синцитиальный), вирус кори.
Образование включений — одно из проявлений ЦПЭ. Включения могут формироваться как в цитоплазме (например, тельца Гуарниери, образуемые вирусом натуральной оспы), так и в ядрах клеток (например, аденовирусы).
При размножении вирусов в культуре клеток последние приобретают способность адсорбировать па себе эритроциты (реакция гемадсорбции) при слабовыраженном или отсутствующем ЦПЭ, а также в ранние сроки размножения вирусов в клетках до возникновения ЦПЭ.
Увеличение массы вирусов — образование бляшек или колоний вирусов (например, у вирусов оспы, кори, полиомиелита и др.) обнаруживается па однослойных клеточных культурах при использовании так называемого агарового покрытия.
Опасность культивирования вирусов. Осложнения вирусной биотехнологии. Однако, вероятность того, что
ДНК из постоянных клеточных линий способна вызывать опухоли у людей, считается крайне низкой. Даже подкожное введение людям больших количеств клеток HeLa не сопровождалось канцерогенным действием. Анализ имеющихся экспериментальных данных показывает, что концентрация ДНК в культуральных жидкостях постоянных линий клеток гораздо ниже возможных трансформирующих уровней.
Совещание экспертов ВОЗ в Лондоне в 1989 г. определило, что предельное содержание гетерогенной ДНК (из клеточных систем и сконструированных векторов) в одной парентеральной дозе вакцин медицинского назначения не должно превышать 100 пкг. Подкожное введение 2 мкг ДНК вируса полиомы вызывает образование опухолей у 50% чувствительных животных. 100 пкг гетерогенной ДНК составляет 0,5х10-4 туморогенной дозы. Контаминирующая ДНК способна подавлять супрессорные гены или активировать протоонкогены после интеграции в клеточный геном. Риск мало зависит от происхождения контаминирующей ДНК. Все последовательности ДНК, обладающие характеристиками сильных промоторов, могут после рекомбинации создавать одинаковый риск.
Вероятность присутствия опасной активности на 1 молекулу ДНК составляет 10
-6—10
-19. Особую опасность могут представлять многокопийные плазмиды, амплифицированные сильные промоторные последовательности. Белковые контаминанты с коротким сроком жизни представляют меньший риск. Таким образом, принято считать, что риск, связанный с примесью гетерогенной клеточной ДНК, ничтожен, если ее количество не превышает 100 пкг в одной дозе препарата, вводимого парентерально. При оральном применении вакцины этот риск еще более снижается. Агенты, применяемые для инактивации вирусов в вакцинах, могут снижать или устранять биологическую активность гетерогенной клеточной ДНК, повышая тем самым их безопасность даже в тех случаях, когда количество ДНК в дозе вакцины, вводимой парентерально, превышает 100 пкг.
Кроме того, современные
методы очистки вирусных препаратов позволяют снизить содержание клеточной ДНК до уровня, при котором ее присутствие даже теоретически не представляет опасности. Высокая степень очистки от клеточной ДНК (10 пкг/мл) достигнута при изготовлении лимфобластоидного интерферона, вакцины против полиомиелита на клетках Vero и поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках СНО.
Риск,
обусловленный вирусной контаминацией постоянных линий клеток может быть связан с полными вирусами, механизм репликации которых известен, вирусными частицами, напоминающими ретро-вирусы типа А, а также вирусными генами, интегрированными в ДНК таких клеток. При использовании постоянных клеточных линий для снижения или устранения риска вирусной контаминации следует, прежде всего, применять систему посевных клеток.
Создание резервных запасов постоянных линий клеток, проверенных в соответствии с требованиями ВОЗ (1982, 1987 гг.), является необходимым условием производства лицензированных вакцин. Предполагаемый риск, связанный с белками, кодируемыми онкогенами постоянных линий клеток, ограничен лишь факторами роста, действие которых транзисторно и обратимо. В обнаруживаемых концентрациях они не представляют серьезной опасности и, кроме того, многие из них быстро разрушаются.
Методы контроля должны гарантировать отсутствие в конечном препарате биологически активных количеств потенциально онкогенных примесей (гетерогенная ДНК, трансформирующие белки, эндогенные вирусы). Исследовательские группы, рассматривавшие проблему приготовления медицинских иммунобиологических препаратов, пришли к заключению, что несмотря на существование потенциального риска, данные, подтверждающие безопасность препаратов, оправдывают их применение.
В 1985 г. Комитетом экспертов по
стандартизации биологических препаратов были приняты «Требования к непрерывным линиям клеток, используемым в производстве биологических продуктов». Отмена запрета на использование постоянных клеточных линий в качестве субстрата в производстве медицинских биологических препаратов открыла новые возможности в деле расширения производства вирусных препаратов, повышения их качества и снижения стоимости.
В настоящее время в ряде стран широко используют постоянные линии клеток для изготовления медицинских биопрепаратов. Использование постоянных линий клеток в качестве субстрата в производстве вирусных вакцин имеет ряд преимуществ. Они не требуют сложных условий культивирования, их можно выращивать в промышленных культиваторах и ферментерах, хорошо изучить и охарактеризовать, а маточные расплодки, свободные от контаминации эндогенными и экзогенными вирусами, длительно хранить при низкой температуре. Многие ученые считают, что приготовление вакцин с использованием клеток Vero по сравнению с первичными культурами клеток почек обезьян, представляет меньший риск вирусной контаминации. Накапливается все больше данных, что клетки Vero и ВНК-21 - безопасные субстраты для производства медицинских биопрепаратов.
Клетки Vero не обладали туморогенными свойствами, а клетки ВНК-21 (клон 13) оставались кариологически стабильными в течение 52 пассажей.
Изучение чистоты и
биологической безопасности белка клеток показало отсутствие посторонних вирусов, а также следов вирусных последовательностей в геноме клеток Vero.
Клетки Vero используют в производстве вакцин против полиомиелита и бешенства человека. Инактивированная полиовакцина улучшенного качества лицензирована в 1982 г., в последующие 5 лет ею было привито более 20 млн. детей без побочного эффекта. В 1988 г. ее производство составило 60 млн. доз. Инактивированная вакцина против бешенства лицензирована в 1985 г. В последующий период были использованы сотни тысяч доз вакцины при низком уровне клинических реакций. Успешно завершились широкомасштабные клинические испытания живой полиовакцины для орального применения из вируса, размноженного в клетках Vero.
В 1987 г. во Франции лицензирована
компонентная вакцина против гепатита В, изготавливаемая на основе рекомбинантной линии клеток СНО. В Великобритании, Японии и Китае получали интерферон в культуре постоянной линии клеток Namalva.
В связи с возможностью
клинического применения моноклональных антител, актуальность приобретает культивирование таких клеток в больших масштабах. Предварительные результаты показывают, что непрерывное крупномасштабное культивирование гибридом в свободной суспензионной культуре в сочетании с непрерывным диализом культуральной среды может дать хороший урожай секретируемых антител (100—140 мг/л). При крупномасштабном производстве один работающий 1000-литровый ферментер фирмы Celltech может обеспечить получение килограммовых количеств моноклональных антител. Кроме того, гибридные клеточные линии сами по себе могут быть использованы в качестве субстрата для репродукции вирусов.
Таким образом, только
пересмотр существующих ограничений по применению тканевых культуральных систем для производства вирусных вакцин позволяет использовать индустриальные методы массового выращивания вирусов на основе суспензионного культивирования - подобно тому, как это делают в микробиологической промышленности. Ученых, работающих в этой области, не обескураживают даже очевидные успехи генной инженерии. Многие ученые считают, что генная инженерия с использованием микроорганизмов может упразднить проблемы, связанные с развитием и использованием массового культивирования клеток животных, и поэтому технология, основанная на их применении, не имеет будущего. Однако в конкуренции традиционной и новой технологий изготовления вирусных препаратов, где решающее значение имеет качество конечного продукта, обнаружились непредвиденные обстоятельства.
Во-первых, при попытке
экспрессии вирусных генов в прокариотических организмах не всегда получены удовлетворительные практические результаты.
Во-вторых, с тех пор как стало возможным
клонировать в клетках животных гены, кодирующие вирусные белки, важность крупномасштабного производства клеточных культур еще более возросла. Данные обстоятельства позволили выразить надежду, что биотехнология клеток животных сохранит свою авангардную роль.
Культивирование и идентификация вирусов.Вирусы культивируют на биологических моделях: в организме лабораторных животных, в развивающихся куриных эмбрионах и культурах клеток (тканей).
Лабораторных животных (взрослых и новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами. Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вирусов, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет имеющегося на поверхности вириона особого белка гемагглютинина. Реакцию проводят вне организма — в пробирках (in vitro), по сути она не является иммунологической реакцией. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях в настоящее время весьма ограничено.
Развивающиеся 5—12-дневные куриные эмбрионы заражают путем введения исследуемого материала в различные полости и ткани зародыша (рис.3.3). Индикацию вирусов осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА. Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц широко используют при промышленном выращивании вирусов.