Пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь.

Сообщество студентов Кировской ГМА

Август 17, 2017, 16:48:52

Автор Тема: Физиология бактерий Занятие №14  (Прочитано 14870 раз)

Оффлайн Lux

  • Administrator
  • Super Star
  • *****
  • Сообщений: 1941
  • Карма: +3/-1
  • Пол: Мужской
  • «Мы русские, мы всё одолеем» - А.Суворов
    • http://vkontakte.ru/club21407095
    • Сообщество студентов Кировской ГМА
  • Курс: ^|^|^

Принципы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Методы культивирования вирусов и бактериофагов.
ЛАБОРАТОРНЫЕ  МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ  ИНФЕКЦИЙ

 Различные  инфекции могут проявляться в организме больного в очень сходных симптомах, и в  тоже время клиническая картина инфекции, вызванная определенным вирусом, может  быть весьма разнообразной по своей симптоматике.
 Определить  возбудителя, особенно при тяжелых заболеваниях,  важно и для прогноза  дальнейшего течения болезни, установления ее  отличий от неинфекционных  заболеваний со сходными симптомами и выбора  правильного способа лечения.  Быстрая лабораторная диагностика позволяет  провести неотложные и правильные противоэпидемические мероприятия и  обнаружить источник вирусной инфекции.

 Лабораторные методы при диагностике  вирусных инфекций включают:
 
  • выделение и идентификацию возбудителя;
  • обнаружение и определение титров противовирусных  антител;
  • обнаружение антигенов вирусов в образцах  исследуемого материала;
  • микроскопическое исследование препаратов  исследуемого материала.
  Забор материала. При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
 
  • образцы следует отбирать как можно раньше либо с  учетом ритма циркуляции возбудителя;
  • материал следует отбирать в объеме, достаточном  для всего комплекса исследований;
  • образцы следует доставлять в лабораторию   незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке  (не более  5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной - при  температуре -50°С.
Выделение и культивирование вирусов

 Вирусы  размножаются только в живых клетках. В лаборатории их культивируют в культурах  клеток, куриных эмбрионах или организмах чувствительных животных.
Для диагностики  вирусных заболеваний применяют следующие методы:
 
  • Вирусоcкопический.
  • Иммунной  электронной   микроскопии.
  • Вирусологический.
  • Серологический.
  • Иммунофлюоресцентный.
  • Биологический.
  • Использование  ДНК-(РНК)-зондов.
  • Цепная  полимеразная   реакция.
Рис. 1. Для лабораторной диагностики вирусных инфекций чаще используют серологические методы исследования. Идентификация вирусов

 Идентификацию вирусов проводят  качественным и  количественным определением вирусов, по морфологии вирусов и с  помощью  серологических методов.
 
 Рис. 2. Герпесвирус (слева), вирус гепатита В (справа) электронная микроскопия. 
 Рис. 3. Вирус гриппа (слева), вирус иммунодефицита человека (справа) электронная микроскопия. Культивирование вирусов Для выделения и культивирования вирусов используются чувствительные биологические модели: лабораторные животные, развивающиеся куриные эмбрионы (7— 13-дневные) и культуры клеток (первично-трипсипизированные, перевиваемые и полуперевиваемые линии).
Культивирование на животных.  Лабораторные животные в настоящее время чаще используются для изучения  вопросов патогенеза и иммунитета, чем для культивирования вирусов.  Основными экспериментальными моделями служат следующие животные: белые  мыши (при выделении вирусов бешенства, энцефалитов, гриппа и вирусов  Коксаки), хорьки (вируса гриппа), кролики (вирусов оспы, бешенства),  обезьяны (вируса полиомиелита).
Культивирование в куриных эмбрионах.  Большинство вирусов обладает способностью размножаться в курином  эмбрионе. Преимуществом этого метода является отсутствие спонтанных  вирусных инфекций, а замкнутая полость эмбриона служит надежной защитой  от попадания микроорганизмов из окружающей среды. Культивирование в  курином эмбрионе применяется при первичном выделении вирусов из  патологического материала, а также при необходимости пассировать и  сохранять вирусы, получать необходимое количество вирусов— при  изготовлении некоторых живых вакцин и диагностических препаратов.
Культивирование  в культурах клеток и тканей. Является одним из основных методов  выделения и изучения вирусов. С введением в 1948—1952 гг. метода  клеточных культур были выделены ранее неизвестные вирусу  усовершенствована и упрощена диагностика вирусных заболеваний, улучшено  производство вакцин и диагностических препаратов, открыты новые  возможности для изучения взаимодействия вируса и клетки. Преимущество  метода культивирования вирусов в культуре клеток состоит в том, что  почти к каждому вирусу можно подобрать чувствительные клетки или ткани,  создать стандартные условия   (наличие клеток одного типа).
Для  приготовления культур клеток чаще всего используются эмбриональные ткани  (человека, различных животных, птиц) и клетки злокачественных  образований, отличающиеся более активной способностью к размножению.  Применяются и нормальные ткани человека, обезьян и некоторых других  видов животных.
В зависимости от методики первичной эксплантации  ткани и техники культивирования различают несколько типов Культур клеток  и тканей:
I.   Культуры переживающих эксплантатов тканей.
II.   Культуры растущих тканей:
1)   культуры фиксированных кусочков ткани;
2) однослойные культуры клеток: а) первично-трипсинизированные (однократно  культивируемые); б) перевиваемые клеточные культуры; в) полуперевиваемые культуры клеток (штаммы диплоидных клеток человека и животных).
III. Суспензионные культуры растущих клеток.
Однослойные культуры растущих клеток составляют
основную культуру клеток современной лабораторной и производственной вирусологической практики. Различают два основных вида однослойных культур клеток: первичные и. перевиваемые.
1. Однослойные первично-трипсинизированные, которые получают обработкой исходной ткани трипсином. Эти клетки размножаются только в первых генерациях. Для получения трипсинизированных культур клеток можно использовать любую ткань — эмбриональную (человека, животных или птиц), а также ткань взрослого человека как нормального, так и опухолевого происхождения.
2. Перевиваемые культуры клеток — клетки, обладающие способностью к размножению и перевивкам вне организма при специальных условиях культивирования. Их получают из нормальных и злокачественных тканей; они могут сохраняться в лабораториях десятки лет посредством постоянного пассирования. К настоящему времени получено и применяется свыше 200 линий клеток. Перевиваемые культуры клеток имеют следующие преимущества: 1) работа по их получению менее трудоемка по сравнению с приготовлением  первичных культур клеток и дешевле; 2) клетки имеют одинаковую форму и  стабильны в своих свойствах.
При культивировании вирусов в культуре  клеток подбирается наиболее чувствительная к данному вирусу ткань, на  которой возможно его активное размножение.
В зависимости от свойств  вируса и типа зараженных им клеток исходом взаимодействия вируса с  клеткой могут быть следующие изменения культур клеток.
Цитопатический  эффект (ЦПЭ) — развитие дегенеративных процессов в клетках (рис. 20).  Эти изменения связаны с нарушением метаболизма в клетках и являются  строго специфическими для проявления жизнедеятельности каждого вида  вируса, отличающимися характером изменений. Наблюдать ЦПЭ можно под  малым увеличением микроскопа, поместив пробирку со слоем клеток и а  предметный столик. Например, вирусы полиомиелита вызывают мелкозернистую  деструкцию клеток, нарушают связи между клетками, которые приобретают  округлую форму. Аденовирусы, размножаясь в клетках, превращают их в  мелкие округлые скопления, напоминающие виноградные гроздья.
Образование  симпластов — гигантских многоядерных клеток в результате слияния  цитоплазмы нескольких клеток и амитотического деления. Такие изменения  вызывает вирус PC (респираторно-синцитиальный), вирус кори.
Образование включений — одно из проявлений ЦПЭ. Включения могут формироваться как в цитоплазме (например, тельца Гуарниери, образуемые вирусом натуральной оспы), так и в ядрах клеток (например, аденовирусы).
При размножении вирусов в культуре клеток последние приобретают способность адсорбировать па себе эритроциты (реакция гемадсорбции) при слабовыраженном или отсутствующем ЦПЭ, а также в ранние сроки размножения вирусов в клетках до возникновения ЦПЭ.
Увеличение массы вирусов — образование бляшек или колоний вирусов (например, у вирусов оспы, кори, полиомиелита и др.) обнаруживается па однослойных клеточных культурах при использовании так называемого агарового покрытия.
Опасность культивирования вирусов. Осложнения вирусной биотехнологии.     Однако, вероятность того, что ДНК из постоянных клеточных линий способна вызывать опухоли у людей, считается крайне низкой. Даже подкожное введение людям больших количеств клеток HeLa не сопровождалось канцерогенным действием. Анализ имеющихся экспериментальных данных показывает, что концентрация ДНК в культуральных жидкостях постоянных линий клеток гораздо ниже возможных трансформирующих уровней.
Совещание экспертов ВОЗ в Лондоне в 1989 г. определило, что  предельное содержание гетерогенной ДНК (из клеточных систем и  сконструированных векторов) в одной парентеральной дозе вакцин медицинского назначения не должно превышать 100 пкг. Подкожное введение 2  мкг ДНК вируса полиомы вызывает образование опухолей у 50% чувствительных животных. 100 пкг гетерогенной ДНК составляет 0,5х10-4 туморогенной дозы. Контаминирующая ДНК способна подавлять супрессорные гены или активировать протоонкогены после интеграции в клеточный геном. Риск мало зависит от происхождения контаминирующей ДНК. Все последовательности ДНК, обладающие характеристиками сильных промоторов, могут после рекомбинации создавать одинаковый риск.
Вероятность присутствия опасной активности на 1 молекулу ДНК составляет 10-6—10-19. Особую опасность могут представлять многокопийные плазмиды, амплифицированные сильные промоторные последовательности. Белковые контаминанты с коротким сроком жизни представляют меньший риск. Таким образом, принято считать, что риск, связанный с примесью гетерогенной клеточной ДНК, ничтожен, если ее количество не превышает 100 пкг в одной дозе препарата, вводимого парентерально. При оральном применении вакцины этот риск еще более снижается. Агенты, применяемые для инактивации вирусов в вакцинах, могут снижать или устранять биологическую активность гетерогенной клеточной ДНК, повышая тем самым их безопасность даже в тех случаях, когда количество ДНК в дозе вакцины, вводимой парентерально, превышает 100 пкг.
Кроме того, современные методы очистки вирусных препаратов позволяют снизить содержание клеточной ДНК до уровня, при котором ее присутствие даже теоретически не представляет опасности. Высокая степень очистки от клеточной ДНК (10 пкг/мл) достигнута при изготовлении лимфобластоидного интерферона, вакцины против полиомиелита на клетках Vero и поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках СНО.
Риск, обусловленный вирусной контаминацией постоянных линий  клеток может быть связан с полными вирусами, механизм репликации которых  известен, вирусными частицами, напоминающими ретро-вирусы типа А, а  также вирусными генами, интегрированными в ДНК таких клеток. При  использовании постоянных клеточных линий для снижения или устранения  риска вирусной контаминации следует, прежде всего, применять систему  посевных клеток.
Создание резервных запасов постоянных линий клеток, проверенных в соответствии с требованиями ВОЗ (1982, 1987 гг.), является  необходимым условием производства лицензированных вакцин. Предполагаемый риск, связанный с белками, кодируемыми онкогенами постоянных линий клеток, ограничен лишь факторами роста, действие которых транзисторно и обратимо. В обнаруживаемых концентрациях они не представляют серьезной опасности и, кроме того, многие из них быстро разрушаются.
Методы контроля должны гарантировать отсутствие в конечном  препарате биологически активных количеств потенциально онкогенных  примесей (гетерогенная ДНК, трансформирующие белки, эндогенные вирусы).  Исследовательские группы, рассматривавшие проблему приготовления  медицинских иммунобиологических препаратов, пришли к заключению, что  несмотря на существование потенциального риска, данные, подтверждающие  безопасность препаратов, оправдывают их применение.
В 1985 г. Комитетом экспертов по стандартизации биологических препаратов были приняты «Требования к непрерывным линиям клеток, используемым в производстве биологических продуктов». Отмена запрета на использование постоянных клеточных линий в качестве субстрата в производстве медицинских биологических препаратов открыла новые возможности в деле расширения производства вирусных препаратов, повышения их качества и снижения стоимости.
В настоящее время в ряде стран широко используют постоянные  линии клеток для изготовления медицинских биопрепаратов. Использование  постоянных линий клеток в качестве субстрата в производстве вирусных  вакцин имеет ряд преимуществ. Они не требуют сложных условий  культивирования, их можно выращивать в промышленных культиваторах и  ферментерах, хорошо изучить и охарактеризовать, а маточные расплодки,  свободные от контаминации эндогенными и экзогенными вирусами, длительно  хранить при низкой температуре. Многие ученые считают, что приготовление  вакцин с использованием клеток Vero по сравнению с первичными  культурами клеток почек обезьян, представляет меньший риск вирусной  контаминации. Накапливается все больше данных, что клетки Vero и ВНК-21 -  безопасные субстраты для производства медицинских биопрепаратов. 
Клетки Vero не обладали туморогенными свойствами, а клетки ВНК-21 (клон 13) оставались кариологически стабильными в течение 52 пассажей.
Изучение чистоты и биологической безопасности белка клеток показало отсутствие посторонних вирусов, а также следов вирусных последовательностей в геноме клеток Vero.
Клетки Vero используют в производстве вакцин против полиомиелита и бешенства человека. Инактивированная полиовакцина улучшенного качества лицензирована в 1982 г., в последующие 5 лет ею было привито более 20 млн. детей без побочного эффекта. В 1988 г. ее производство составило 60 млн. доз. Инактивированная вакцина против бешенства лицензирована в 1985 г. В последующий период были использованы сотни тысяч доз вакцины при низком уровне клинических реакций. Успешно завершились широкомасштабные клинические испытания живой полиовакцины для орального применения из вируса, размноженного в клетках Vero.
В 1987 г. во Франции лицензирована компонентная вакцина против гепатита В, изготавливаемая на основе рекомбинантной линии клеток СНО. В Великобритании, Японии и Китае получали интерферон в культуре постоянной линии клеток Namalva.
В связи с возможностью клинического применения моноклональных антител, актуальность приобретает культивирование таких клеток в больших масштабах. Предварительные результаты показывают, что непрерывное крупномасштабное культивирование гибридом в свободной суспензионной культуре в сочетании с непрерывным диализом культуральной среды может дать хороший урожай секретируемых антител (100—140 мг/л). При крупномасштабном производстве один работающий 1000-литровый ферментер фирмы Celltech может обеспечить получение килограммовых количеств моноклональных антител. Кроме того, гибридные клеточные линии сами по себе могут быть использованы в качестве субстрата для репродукции вирусов.
Таким образом, только пересмотр существующих ограничений по  применению тканевых культуральных систем для производства вирусных  вакцин позволяет использовать индустриальные методы массового  выращивания вирусов на основе суспензионного культивирования - подобно  тому, как это делают в микробиологической промышленности. Ученых,  работающих в этой области, не обескураживают даже очевидные успехи  генной инженерии. Многие ученые считают, что генная инженерия с  использованием микроорганизмов может упразднить проблемы, связанные с  развитием и использованием массового культивирования клеток животных, и  поэтому технология, основанная на их применении, не имеет будущего.  Однако в конкуренции традиционной и новой технологий изготовления  вирусных препаратов, где решающее значение имеет качество конечного  продукта, обнаружились непредвиденные обстоятельства.
Во-первых, при попытке экспрессии вирусных генов в прокариотических организмах не всегда получены удовлетворительные практические результаты. 
Во-вторых, с тех пор как стало возможным клонировать в клетках животных гены, кодирующие вирусные белки, важность крупномасштабного производства клеточных культур еще более возросла. Данные обстоятельства позволили выразить надежду, что биотехнология клеток животных сохранит свою авангардную роль.
Культивирование и идентификация вирусов.
Вирусы культивируют на биологических моделях: в организме лабораторных  животных, в развивающихся куриных эмбрионах и культурах клеток (тканей).
 Лабораторных животных (взрослых и новорожденных белых мышей, хомяков,  кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом  различными способами. Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения  вирусов, устанавливают на основании развития типичных признаков  заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или  положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на  способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание)  эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет имеющегося  на поверхности вириона особого белка гемагглютинина. Реакцию проводят  вне организма — в пробирках (in vitro), по сути она не является  иммунологической реакцией. Использование животных для культивирования  вирусов в диагностических целях в настоящее время весьма ограничено.
 Развивающиеся 5—12-дневные куриные эмбрионы заражают путем введения  исследуемого материала в различные полости и ткани зародыша (рис.3.3).  Индикацию вирусов осуществляют на основании специфических поражений  оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА.  Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц широко используют при промышленном выращивании вирусов.
Делай что должен, и будь что будет.

Реквизиты для пожертвований на сайт:
WebMoney R368719312927 
ЯндексДеньги 41001757556885

Оффлайн Lux

  • Administrator
  • Super Star
  • *****
  • Сообщений: 1941
  • Карма: +3/-1
  • Пол: Мужской
  • «Мы русские, мы всё одолеем» - А.Суворов
    • http://vkontakte.ru/club21407095
    • Сообщество студентов Кировской ГМА
  • Курс: ^|^|^

Среды для выращивания вирусов. Клеточные субстраты в вирусологии.     В течение многих лет разрабатывались методы выращивания небольших количеств клеток животных в лабораторных условиях. Однако наладить массовое культивирование таких клеток оказалось не простой задачей. Способ выращивания, характер используемой среды, методы управления и контроля в значительной степени зависят от типа выращиваемых клеток. Все культивируемые клетки первоначально получают от животных путем механической или ферментативной дезагрегации нормальных или малигинизированных тканей либо с помощью перфузии in vivo.
Тканевые эксплантаты или клетки, помещенные в подходящую  среду, развиваются в первичные культуры с «нормальным» (диплоидным) или  «ненормальным» (трансформированным или происходящим из опухоли)  карио-типом. Классификация культивируемых клеток представляет определенные трудности. Различают первичные культуры клеток и клеточные  линии. В производстве вакцин используют, главным образом, три типа  клеток; первичные; диплоидные клеточные линии; непрерывные (постоянные)  клеточные линии. Первичная культура - это культура, происходящая от  клеток тканей или органов, взятых непосредственно из организма. 
Культура считается первичной до тех пор, пока ее не субкультивируют, после чего она становится клеточной линией.
Первичные культуры обычно получают трипсинизацией тканей  куриных эмбрионов или тканей (чаще всего почек), взятых от других видов  здоровых животных. Возраст используемых эмбрионов может значительно  различаться и влиять на выход и жизнеспособность клеток. Для более  полного контроля доноров ткани их следует брать из SPF-хозяйств.
Первичные культуры клеток почек зеленых мартышек обычно  используют для приготовления полиовирусной вакцины. Поскольку обезьяны  являются очень дорогим объектом для увеличения выхода клеток почки  дезагрегируют методом перфузионной трипсинизации in vivo, а затем первичную культуру выращивают на микроносителях. Для изготовления других  медицинских вакцин широко применяют первичную культуру клеток почки  кроликов, телят и других животных. Для изготовления вакцин, используемых  в ветеринарной медицине, чаще всего применяют первичные культуры клеток  куриных эмбрионов и почек естественного хозяина или восприимчивых  животных.
Первичные культуры в зависимости от типа ткани и условий  выращивания значительно различаются. Некоторые из них погибают через  несколько дней после посева, тогда как другие могут длительно сохраняться в культуре без заметных морфологических и биохимических изменений. С момента приготовления первичной культуры до остановки роста клеток и гибели культуры после серийных пересевов проходит от нескольких недель до нескольких месяцев. Клетки эмбрионального происхождения при культивировании обычно сохраняют жизнеспособность более продолжительное время.
Линия клеток - первичная культура, со времени получения  субкультуры клеточные линии могут иметь ограниченный срок жизни in vitro  (например, диплоидные фибробласты человека и животных), а могут  размножаться in vitro неограниченно долго. В последнем случае их называют постоянными, стабильными или непрерывными клеточными линиями.
Линия диплоидных клеток — клеточная линия, в которой, по  крайней мере, 75% клеток обладает кариотипом нормальных клеток исходного  вида. Следует отметить, что диплоидный набор хромосом не обязательно  эквивалентен диплоидному кариотипу, поскольку существуют ситуации, при  которых клетка может терять один тип хромосом и приобретать другой.  Следовательно, кариотип клетки изменился, а диплоидный набор хромосом  сохранился. Такие клетки следует считать «псевдодиплоидными». Диплоидные  культуры фибробластов человека могут пассироваться многократно. Такие  культуры часто называют штаммами. Некоторые из них могут сохранять  диплоидный статус в течение 80 и даже более популяционных делений.
В связи с трудностями получения соответствующих количеств первичных культур клеток почки зеленой мартышки (по причине стоимости) и преимуществами использования предварительно изученных клеточных культур для производства вакцины против полиомиелита и других вакцин были лицензированы диплоидные линии клеток WI-38 и MRC-5. Существуют сомнения в том, что ростовые свойства и продуктивность диплоидных клеток варьируют. Даже хорошо охарактеризованные диплоидные линии клеток ведут себя неодинаково при работе с ними различных исследователей.
Штамм клеток — популяция однородных клеток (по одному или  нескольким маркерам), сохраняющая специфические свойства в течение  ограниченного периода культивирования. Штамм клеток может происходить из  первичной культуры либо от линии клеток, получающих специфические  свойства путем селекции или клонирования.
Линия гетероплоидных клеток. Этот термин означает, что  клеточная линия имеет менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом.  Этот термин не означает, что клетки являются злокачественными или  способны расти до бесконечности.
Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.     Развитие специфической профилактики инфекционных заболеваний человека и животных создало необходимость разработки методов массового получения вирусного сырья.
В течение многих лет заражение животных оставалось единственным методом культивирования вирусов, что служило серьезным препятствием для получения высококачественных вирусных вакцин и в достаточном количестве. До сих пор не удалось культивировать in vitro некоторые вирусы (папилломы человека и др.).
Использование куриных эмбрионов — важный шаг на пути разработки вирусных вакцин. В силу высокой производительности и отличного накопления некоторых вирусов этот метод не потерял своей актуальности. Его и сейчас с успехом применяют для изготовления вакцин против ряда заболеваний человека и животных.
Большое накопление некоторых вирусов в организме составляет  серьезную конкуренцию методам их размножения в клеточных культурах. Это,  прежде всего, относится к вирусу гепатита В, который накапливается в  плазме крови человека в высоком титре (1012—1013 частиц/мл) и является  прекрасным источником вирусного антигена для приготовления  инактивированной вакцины.
Другим примером может служить вирус миелобластоза птиц, который при экспериментальном заражении цыплят накапливается в плазме крови в титре 5х1012 вирусных частиц/мл и является хорошим источником препаративного получения ре-вертазы.
Значительные успехи в области выращивания вирусов животных вне  организма прежде всего связаны с открытием возможности выращивания  полиовируса в экстраневральных тканях (Эндерс и сотр., 1949) и  усовершенствованием метода тканевых культур (Дульбекко и др., 1952).  Этому в огромной степени способствовало также открытие антибиотиков и  создание синтетических и полусинтетических питательных сред. Указанные  достижения обеспечили возможность обновить методы получения ранее  существовавших препаратов и создать новые эффективные вакцины против  ряда вирусных болезней.
В производстве вирусных препаратов широкое применение нашли первичные культуры и линии клеток. Для приготовления живых и инактивированных вакцин человека, а также животных, часто используют вирус, выращенный в первичных культурах клеток животных. В последнее время инактивированные вакцины, предназначенные для вакцинации людей, все чаще готовят с использованием клеточных линий. Для некоторых вакцин, применяемых в животноводческой практике, вирус выращивают в культурах постоянных клеточных линий. Перспектива использования постоянных линий клеток особенно заманчива в плане крупномасштабного суспензионного культивирования.
Выбор метода получения вирусного сырья в каждом конкретном случае определяется специфическими требованиями, предъявляемыми к готовому препарату.
Получение большого количества вирусного сырья с выраженной  антигенной активностью особенно необходимо для инактивированных вакцин.  Изготовление некоторых из них, применяемых в животноводческой практике,  достигло огромных масштабов. С точки зрения технологии крупномасштабного  производства вирусных препаратов, метод культивирования вируса должен  основываться на потреблении доступных, недорогих, максимально  стандартизированных клеточных субстратов и питательных сред,  обеспечивать достаточное накопление вируса или вирусного антигена и  иметь высокую производительность.
В настоящее время разработаны и широко применяются методы производственного выращивания ряда вирусов человека и животных с целью изготовления вирусных препаратов. Однако, учитывая исключительную практическую важность исследований и разработок в этой области, они постоянно направлены на поиски новых принципов и технологических решений.
Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам. Культуры диплоидных клеток тестикулярной ткани ягнят используют в производстве живой вакцины против классической чумы свиней,  а тканей легкого эмбриона крупного рогатого скота — для размножения  вакцинных штаммов, вирусов чумы крупного рогатого скота и оспы овец.  Полевой изолят вируса геморрагической болезни кроликов размножался в  штамме клеток почки кролика (DJRK), вызывая ЦПЭ после двух пассажей.
Для выделения и репродукции некоторых вирусов используют  специальные линии клеток. Например, для вирусов диареи и ринотрахеита  крупного рогатого скота высокочувствительными оказались линии клеток  слизистой оболочки носа крупного рогатого скота и легких норок, для  многих вирусов свиней — гомологичные линии клеток, а для ротавирусов —  линия клеток обезьян (МА-104).
Постоянные линии клеток, полученные из одних и тех же тканей  одного вида животного, так же как их сублинии (клеточные клоны), могут  значительно различаться между собой спектром чувствительности и вирусной  репродукцией.
Продукция вируса лейкоза крупного рогатого скота в хронически  инфицированных однослойной и суспензионной культурах в зависимости от  используемой сублинии клеток FLK (foetal lamb kidney) может различаться в  10 раз. Клонированные сублинии клеток ВНК-21 значительно различались  между собой чувствительностью к некоторым типам и штаммам вируса ящура. В  суспензионной культуре клеток ВНК-21 по мере  длительного пассирования  (200 пассажей) наблюдается снижение выхода  вируса ящура вследствие  нарушения морфогенеза на стадии прокапсида.
Адаптированные к размножению вне организма штаммы вируса  размножаются в культурах, как правило, быстрее и с большим выходом, чем  неадаптированные «дикие» штаммы. Лучше всего размножаются штаммы,  адаптированные к данной культуре, хотя их размножению часто способствует  первоначальная адаптация к другим клеточным культурам. Многие вирусы,  элективной системой для которых являются культуры клеток гемопоэ-тической системы естественного хозяина, хорошо размножаются в них без адаптации.
При адаптации вирусов, размножающихся медленно и не вызывающих  или вызывающих слабый ЦПЭ, целесообразно однослойные инфицированные  культуры инкубировать длительно (2—4 недели) и использовать пересев  инфицированных клеток. В качестве примера может служить вирус  иммунодефицита кошек (штамм Петалюма), который вызывал ЦПЭ в культуре  клеток кошачьей Т4-тимус-лимфомы 3101 через 22 дня после заражения.
Адаптация некоторых вирусов и вирусных штаммов к размножению в  культуре клеток — трудный процесс, который требует нетрадиционных  подходов. Для адаптации вируса гриппа к новой хозяинной системе  предложено использовать метод форсированных пассажей, при котором  проводят серию одноцикловых репликаций вируса. Для серийных пассажей  применяют «ранний» урожай вируса без разведения. Положительные результаты получали при сокультивировании инфицированных клеток и тех,  к  которым желательно адаптировать вирус.
Способный к размножению в организме кроликов штамм L вируса  чумы крупного рогатого скота адаптировали в культуре клеток его  путем  культивирования смеси лимфоцитов селезенки зараженного кролика и  клеток  Vero в присутствии ПЭГ. Внеклеточный вирус не обнаруживали в  течение  трех пассажей. К 11 пассажу вирус накапливался в титре 5,5 lg  ТЦД50/мл и  кроме клеток Vero приобрел способность размножаться в  клеточных линиях  ВНК-21, С-1, К-13 непермис-сивных для исходного штамма  вируса. Линия  клеток (FLK — BLV), хронически инфицированная вирусом  энзоотического  лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), получена при  сокультивировании  клеток почки плода овцы и лимфоцитов крупного  рогатого скота,  инфицированного ВЛКРС.
Вирус иммунодефицитоподобного заболевания крупного рогатого  скота выделяли от естественно и экспериментально инфицированных телят  сокультивированием клеток крови с клетками селезенки плода коров.  Индуцированное вирусом образование синцития реже наблюдали в культурах  клеток почки и легкого плода коров. Вирус иммунодефицита кошек (FIV)  удается выделить путем инокуляции периферической крови или  спинномозговой жидкости больных животных в первичную культуру клеток  глии, лимфоцитов или мононуклеарных клеток крови кошек. Цитопатический  эффект наблюдали через 8—14 дней после сокультивации (клеточные агрегаты  синцитий, цитоплазматические вакуоли).
При культивировании вне организма одни вирусы обладают широким  хозяинным спектром (герпес-, рабдовирусы), другие — узким (napBos  коронавирусы). В последнем случае адаптация вируса к некоторым культурам  обычно принятыми методами не удается. Попытки адаптировать вирус  трансмиссивного гастроэнтерита свиней к постоянной линии клеток почек  поросят (линия LL C-PKI) оказались безуспешными в отличие от культуры  клеток щитовидной железы свиньи.
При культивировании in vitro важное значение могут иметь  изменения вирусов, обусловленные клетками хозяина. Вирус ньюкаслской  болезни, пассируемый в первичной культуре клеток КЭ, по морфологии,  плавучей плотности и устойчивости при градиентном центрифугировании  значительно отличался от вируса, размноженного в КЭ.
Факторы влияющие на размножение вирусов. Размножение вирусов в культуре.     Увеличение продукции вируса представляет собой большой  практический интерес, особенно при массовом производстве вирусных  препаратов. Изучению влияния различных факторов на репродукцию вирусов и  накопление вирусных антигенов в культуре клеток посвящены многие  исследования. Оказалось, что это зависит от ряда условий, оптимизация  которых имеет важное технологическое значение.
Успех культивирования вирусов прежде всего зависит от удачного  выбора клеточного субстрата. Основными критериями при этом являются  высокий выход вируса и вирусного антигена, относительная неприхотливость  к условиям культивирования и безопасность вакцины. Одни вирусы хорошо  размножаются в культурах клеток различного происхождения, другие -  предпочитают клетки естественного хозяина или дифференцированные, либо  требуют специфических условий культивирования (пониженную температуру,  обработку трипсином, высокую или низкую множественность заражения),  третьи — вообще пока не удалось размножить вне организма.
При культивировании вирусов выявлен ряд особенностей,  характерных для отдельных семейств и их представителей. Так, большинство  пикорнавирусов, так же как и парвовирусов размножаются в культурах  клеток естественного хозяина. Основная трудность в работе с ними — выбор  чувствительной культуральной системы. Однако даже при оптимальном  решении этой задачи, урожай различных представителей семейства  пикорнавирусов различается очень сильно. Одни из них (полиовирус, вирус  ящура) накапливаются в высоком титре (7,0—9,0 ТЦД50/мл), что  соответствует выходу, примерно равному 10—1000 инфекционных единиц на  одну клетку.
В то же время другие представители семейства (риновирусы, некоторые энтеровирусы, вирус гепатита А) накапливаются в более низком титре (4,0—6,0 lg Т1ДД50/мл). 
Вирус гепатита А хорошо размножается в культуре клеток печени  обезьяны, а вирус гепатита В впервые in vitro удалось размножить в  культуре клеток гепатомы человека HepG = 2. В культуральную жидкость  выделялись полные частицы вируса, содержащие три оболочечных белка.  Рабдовирусы обладают широким хозяинным спектром in vitro. Вирус  везикулярного стоматита, например, хорошо и быстро размножается  практически во всех использованных для этой цели клеточных культурах,  хотя некоторые представители этого семейства (вирус бешенства)  размножаются медленно и накапливаются в меньшем титре.
 
Представители семейства парамиксовирусов значительно различаются между собой по широте хозяинного спектра клеточных культур.  Одни из них (парамиксовирусы) обладают широким, другие (морбилливирусы) —  узким хозяинным спектром. Респираторно-синцитиальный вирус (PC-вирус),  как и другие представители семейства, размножается во многих клеточных  культурах (но не в культуре куриного эмбриона), хотя накапливается в  значительно более низких титрах. Например, разница в максимальном  накоплении инфекционных частиц, если сравнить его с вирусом ньюкаслской  болезни, достигает 5—6 lg. Вместе с тем следует отметить, что  соотношение инфекционных и физических частиц у PC-вируса может достигать  высоких значений (1:1000—1:10 000).
Вирус диареи крупного рогатого скота обладает узким клеточным  тропизмом и, так же как PC-вирус, накапливается в чувствительных  культурах в невысоком титре (4,0—6,0 lg ТЦД50/мл). Первичная культура  клеток почки телят оказалась более чувствительной к полевым изолятам  вируса диареи, чем постоянная линия этих клеток [977]. Реовирусы  размножаются в культурах клеток различного происхождения, но лучше,  когда выращивание проводят при пониженной температуре (34°С). Однако  представители одного рода этого семейства (ротавирусы) проявляют исключительную щепетильность в отношении клеточного субстрата. Одна из лучших культур для выделения и размножения ротавирусов — постоянная линия клеток почки эмбриона макаки резус (линия МА 104). Для аденовирусов предпочтительным субстратом являются культуры эпителиальных клеток естественного хозяина.
В эпителиоподобных клетках постоянных линий HeLa и KB они  накапливаются в более высоком титре, чем в диплоидных линиях фибробластоподобных клеток (WI-38 или MRC-5).
Культуры клеток беспозвоночных по сравнению с позвоночными во многих случаях оказались более продуктивными в отношении альфа- и флавивирусов.
Первичные культуры клеток, приготовленные из различных тканей  одного вида животных или даже одного донора клеток, могут значительно  различаться по чувствительности к данному вирусу. Большинство вирусов  хорошо накапливаются в культуре клеток паренхиматозных органов, тогда  как некоторые предпочитают клетки гемопоэтической системы  (лимфопролиферативные вирусы, вирусы африканской чумы свиней,  инфекционной анемии лошадей) или нервной ткани. Наиболее широким  спектром чувствительности обладают первичные культуры, представленные  преимущественно эпителиоподобными клетками. Такие культуры, как правило,  получают из почечной ткани различных животных. Аденовирусы свиней  серотипа 2 и 3 хорошо размножались в первичной культуре клеток почки  (6,25—8,0 lg ТЦЦ50/МЛ), и значительно хуже в первичной культуре клеток  тестикулярной ткани поросят. Для вируса контагиозной эктимы овец и коз  более чувствительной оказалась культура тестикулярной ткани овец и коз.
Аналогичные результаты получены в опытах с вирусом висна-мэди.  Вирус энцефаломиелита свиней размножается в культуре клеток почки  свиньи с образованием синцития. В культурах клеток из других тканей  свиньи вирус размножается без ЦПЭ.
Разработаны методы получения эпителиоподобных культур клеток из хориоаллантоисной оболочки куриных эмбрионов. Они оказались более чувствительными и продуктивными для ряда вирусов, чем культуры фибробласто-подобных клеток из тканей куриного эмбриона. Например, клетки хориоаллантоисной оболочки более репродуктивны для вируса ньюкаслской болезни, чем клетки тела куриного эмбриона. Кроме того, клетки одной и той же ткани могут сильно отличаться друг от друга по репродукции вируса. Исследование репродукции вируса ньюкаслской болезни единичными клетками куриного эмбриона показало, что из числа продуцирующих вирус клеток только 20% синтезируют инфекционный вирус в большом количестве. Указанное соотношение клеток сохранялось в культуре из различных тканей эмбриона в течение трех пересевов.
Делай что должен, и будь что будет.

Реквизиты для пожертвований на сайт:
WebMoney R368719312927 
ЯндексДеньги 41001757556885
 

Быстрый ответ

В быстром ответе можно использовать BB-теги и смайлы.

Имя: E-mail:
Визуальная проверка:
Структурная единица легкого:
Переведите с латинского - crista: