Физиология бактерий Занятие №10

[Lux]

Рост и размножение бактерий. питательные среды. Двухфазный рост бактерий. Диауксия. Рост без деления. Оценка роста бактерий. Количественная оценка роста бактерий. Двухфазный рост. У бактерий, способных использовать два различных источника углерода, наблюдают двухфазный рост (так называемая диауксия). Примером может служить рост кишечной палочки на среде с глюкозой и сорбитолом.
• Для подобных микроорганизмов характерен начальный пик роста, в течение которого бактерии утилизируют только один углевод.
• После исчерпания его запасов наступает стационарная фаза, в течение которой в культуре инициируются синтез ферментов и механизмы транспорта для утилизации второго углевода.
• Если физиологические условия удовлетворительны, в бактериальной культуре начинается фаза вторичного экспоненциального роста, инициированная утилизацией второго углевода.
Рост без деления. Рост бактерий не всегда  сопровождается делением. Многие факторы — детергенты, антибиотики, соли  жёлчных кислот, УФ-облучение — задерживают деление клеток. В результате  образуются длинные нитевидные формы, значительно превышающие по размерам  исходные клетки.
 Оценка роста бактерий Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах,  где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение  количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл,  либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах,  отнесённых к единице объёма.
Подсчёт микроорганизмов можно проводить непосредственно под  микроскопом с использованием различных счётных камер (например,  Петрова-Хаузера или Горяева). Если толщина слоя среды с микроорганизмами  0,02 мм, а сторона квадрата на предметном стекле 0,05 мм (объём 5-10^-8cm³),  то количество подсчитанных в квадрате клеток нужно умножить на 2*107,  чтобы получить число клеток в 1 мл. Количество живых клеток определяют,  подсчитывая выросшие на твёрдой питательной среде бактериальные колонии.  При этом учитывают разбавление бактериальной суспензии, сделанное при  посеве.
Прирост биомассы бактерий оценивают после осаждения центрифугированием известного объёма питательной среды с последующим определением массы осадка (так называемый «сырой вес»). Сухой вес определяют, измеряя массу осадка, высушенного при 100 "С

Фотометрические методы измерения мутности бактериальной  суспензии основаны на её способности поглощать либо рассеивать свет  пропорционально количеству бактерий; эти методы широко применяются на  практике. Важно помнить, что линейная зависимость между мутностью  суспензии и бактериальной массой наблюдается только при низких  плотностях клеточных суспензий. Чтобы правильно измерить количество  микроорганизмов в культуре с высокой плотностью, нужно сделать  соответствующее разведение образца.
Подсчёт с использованием автоматических счётчиков, регистрирующих отрицательный заряд поверхности каждой микробной клетки, основан на снижении проводимости раствора электролита при прохождении одной бактерии через узкое отверстие. Недостаток метода заключается в том, что любая частица (немикробная клетка) или несколько слипшихся частиц дают при подсчёте одинаковый результат.
Биохимические методы определения биомассы основаны на  определении общего азота в клетках (метод Кьельдаля), общего углерода  (по ван Слайку-Фолчу), общего белка (по Лоури или Фолину), поскольку в  бактериальной клетке элементный состав довольно стабилен.
В тех случаях, когда плотность клеточной суспензии очень мала, можно использовать иные биохимические подходы (например, измерять поглощение кислорода, образование С02 или кислот).
Факторы влияющие на рост бактерий. Культуральные среды для  роста бактерий. Простые и сложные культуральные среды.  Твердые и жидкие  культуральные среды. Кроме состава питательных сред, на которых развиваются  бактерии, большое значение име ют условия культивирования и, прежде  всего, температура, аэрация и концентрация водородных ионов в среде.
 Культуральные среды для роста бактерий Культуральные среды обычно компонуют, предварительно зная,  рост каких именно физиологических групп микроорганизмов хотят обеспечить. Вначале целесообразно составить минеральную основу, содержащую все необходимые питательные вещества в неорганической форме. Затем в эту основу вводят источники углерода, энергии, азота и необходимые ростовые факторы.
В количественном отношении придерживаются простого правила: соотношение важнейших элементов, вводимых в воду, должно быть примерно таким же, как в бактериальной клетке (например, среднее соотношение углерод:азот:фосфор:сера:калий:кальций:магний:железо = 5:1:0,3:0,1:0,1:0,05:0,05:0,02. В граммах эти величины дают примерное содержание элементов на 1 л среды).
• Для культивирования некоторых бактерий применяют простые синтетические среды, то есть среды, содержащие только определённые химические соединения: источник углерода  (например, глюкозу), аммонийный азот, а также фосфаты, хлориды и  сульфаты, в то время как другим необходима комплексная, или сложная среда, дополненная различными веществами, химический состав которых полностью не определён (например, среда с экстрактами тканей сердца и мозга).
•  По консистенции микробиологические среды разделяют на жидкие (бульон) и твердые (плотные), содержащие около 2% «уплотнителя» — агара (полисахарида, получаемого из  морских водорослей). В некоторых случаях в качестве «уплотнителя» можно  использовать желатину. Среды с небольшим содержанием агара (0,6%) обозначают как полужидкие.
Для промышленного выращивания и автоматизированной диагностики предпочтительна жидкая среда. Выращивание на агаризованных средах необходимо для выделения и дальнейшей оценки отдельных колоний бактерий.
•  Элективные среды применяют для выделения определённых типов  бактерий. Многие микроорганизмы легко обнаруживаются, так как вызывают  заметные изменения в окружающей среде. Выделение этих микроорганизмов в  чистой культуре (клоне) не представляет особые трудностей. Однако есть  много других микроорганизмов, относящихся к разным физиологическим  группам, выделение которых стало доступным лишь после разработки С.Н. Виноградским и М. Бейеринком метода накопительных культур, который подразумевает создание условий (источники энергии, углерода и азота, акцептор электронов, свет, температура, pH и т.п.), обеспечивающих преимущественный рост одного микроорганизма в сравнении с остальными.
В подобной элективной (селективной) среде наиболее приспособленные бактерии бурно растут, вытесняя контаминирующую  микрофлору. Многократный пересев на предпочтительную для данного вида  жидкую среду обеспечивает «обогащение» исходной пробы, часто  контаминированной другими микроорганизмами. Последующий высев на плотную  среда позволяет выделить необходимый штамм. Например, для выделения  патогенных энтеробактерий используют элективные плотные среды, к которым  добавляют соли висмута, а для обнаружения возбудителя дифтерии — среды с  теллуритом. Выросшие на этих средах колонии патогенов, обладающих  способностью восстанавливать ионы редких металлов, имеют металлический  блеск.
•  Некоторые бактерии практически не способны к росту in vitro (например, Mycobacterium leprae, хламидии), что считается проявлением крайней степени паразитизма и связано с утратой ряда важнейших ферментов, необходимых для самостоятельного роста и развития.
Температура роста бактерий. Мезофильные бактерии. Термофильные бактерии. Психрофильные бактерии. Аэрация бактерий. Оптимальная температура роста патогенных для человека микроорганизмов совпадает в основном с температурой тела человека.
В отдельных случаях температурный параметр может быть  использован как простой способ селекции, например, виды Campylobacter  лучше растут при температуре 42 "С, слишком высокой для роста  большинства других патогенов.
В зависимости от требований к температурному режиму бактерии разделяют на три группы:

Мезофильные бактерии лучше всего растут в пределах 20-40 "С; к ним относят большинство патогенных для человека микроорганизмов.
Термофильные бактерии лучше растут при 50-60 "С.
Психрофильные бактерии предпочитают расти в интервале температур от 0 до 10 "С.
 Аэрация бактерий Всем облигатным аэробам в качестве конечного акцептора электронов необходим кислород. При большом объёме жидкости аэробные бактерии могут расти только на поверхности; для роста в глубоких слоях требуется перемешивание. Микроорганизмы могут использовать только растворённый кислород, а его растворимость в воде очень мала (в 1 л при 20 °С содержится 0,28 моля 02, что хватает для окисления лишь 8 мг глюкозы), поэтому запас кислорода обеспечить невозможно, и он должен поступать к среде непрерывно.
Для обогащения жидкости кислородом увеличивают площадь  соприкосновения жидкой и газовой фаз различными способами: культивированием в тонком слое среды, перемешиванием поверхностных и глубоких слоев жидкости путём встряхивания, вращением сосудов вокруг продольной оси, пропусканием воздуха через жидкость под давлением. Для полного связывания растворённого кислорода (техника анаэробных культур) предусмотрено применение прокипячённых питательных сред, закрытых без пузырьков воздуха; создание бескислородной атмосферы в специальных установках для культивирования; применение адсорбентов кислорода (дитионита, хлорида одновалентной меди), восстановителей (аскорбиновой кислоты, тиогликолата, цистеина или сульфида, если бактерии его переносят).
Величина рН необходимая для роста бактерий. Пигменты бактерий. Виды пигментов. Функции пигментов бактерий. Установление и поддержание определённой величины рН (логарифм  величины, обратной концентрации водородных ионов в молях на литр) имеет  существенное значение для роста бактерий. Подавляющее большинство  микроорганизмов хорошо растёт при нейтральном рН, равном 7,0.  Актиномицеты и бактерии, разлагающие мочевину, предпочитают среды с более высоким рН, то есть слегка щелочные. Некоторые бактерии  толерантны к кислой среде (например, лактобациллы). Кислые значения рН  предпочитают грибы.
Поддержание рН особенно необходимо для микроорганизмов,  продуцирующих кислоты, но не обладающих устойчивостью к ним (кишечные  бактерии и псевдомонады). Определённое буферное действие оказывают  фосфаты, при более сильном выделении кислот рекомендуется добавлять к  среде карбонат кальция или бикарбонат натрия. Нарушение метаболизма при  неблагоприятных значениях рН не связано с прямым действием ионов  Н+ и ОН". Они лишь снижают степень диссоциации слабых кислот и  оснований, которые в недиссоциированном состоянии легче проникают в  клетку, чем продукты их диссоциации.

 Пигменты бактерий. Виды пигментов. Функции пигментов бактерий. Колонии многих бактерий могут быть ярко окрашены, что связано с выделением окрашивающего вещества в среду либо окраской самих бактерий. Пигменты бактерий представлены различными веществами — каротиноидами, феназиновыми производными, пирролами, антоциана-ми и др. Пигменты бактерий — вторичные метаболиты, то есть они не являются веществами, обязательно присутствующими у всех бактерий. Например, даже внутри одного вида Serratia mareescens есть пигментообразующие и беспигментные штаммы. Среди пигментов преобладают жёлтые, оранжевые и красные каротиноидные пигменты. Способность к пигментообразованию выражена у видов Sarcina, Micrococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др. Этот признак генетически детерминирован, поэтому его используют в качестве дифференцирующего критерия.
• Пигменты защищают бактерии от действия видимого света и  УФ-лучей. Мутанты, лишённые способности к пигментообразованию, быстро  погибают на свету. Искусственно окрашенные бактерии (например, метиленовым синим) также проявляют повышенную лабильность к инсоляции. Бактерицидное действие солнечного света проявляется в присутствии кислорода и обусловлено фотоокислением. При этом клеточные пигменты (флавины и цитохромы) действуют как катализаторы. 
Каротиноиды ингибируют этот процесс. У некоторых бактерий образование пигментов происходит только на свету (например, каротиноидов у туберкулёзной палочки).
• Многие пигменты проявляют антибиотические свойства. Между  пигментацией и образованием вторичных метаболитов существует такая  тесная корреляция, что при наличии пигментов можно с большой долей  вероятности ожидать образования антибиотиков и других БАВ.
 Рост бактерий в культуре. Фазы роста бактерий. Лаг фаза роста. Экспоненциальная фаза роста бактерий. Стационарная фаза роста.
Собственно под ростом бактерий обычно подразумевают координированную репликацию всех компонентов бактерий. Поскольку деление  бактериальной клетки приводит к образованию двух особей, то их число  растет в геометрической прогрессии: 2₀-2₁-2₂-2₃-..2_n. Регуляторное действие на рост бактерий оказывают качество питательной среды и условия выращивания.
Рост популяции клеток в ограниченном жизненном пространстве (периодическая культура) может быть разделён по меньшей мере на четыре фазы (рис. 4-12).
 Рис. 4-12. Рост бактериальной культуры.
После внесения в среду бактерии адаптируются к её условиям и размножаются сравнительно медленно (лаг-фаза). Затем наступает фаза экспоненциального роста (экспоненциальная фаза). Далее среда истощается, в ней аккумулируются токсические продукты метаболизма, что проявляется снижением темпов размножения и прекращением увеличения числа клеток (стационарная фаза).
Таким образом, рост в периодической культуре подчиняется  закономерностям, действительным не только для одноклеточных, но и для  многоклеточных организмов. В последующем бактериальная культура может  погибнуть либо значительно сократиться (фаза отмирания). Спорообразующие  виды переходят в стадию споруляции, у споронеобразующих видов возможно  образование анабиотических форм (см. ниже). В некоторых случаях  дополнительно выделяют фазу ускорения роста (начало экспоненциальной  фазы) и фазу замедления роста (переход к стационарной фазе).
Лаг-фаза роста бактерий соответствует периоду физиологического  приспособления, включающего индукцию ферментов, синтез и сборку  рибосом. Продолжительность фазы зависит главным образом от возраста  посевного материала (инокулята) бактерий и предшествовавших условий  культивирования Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной  фазе роста), то бактериям необходимо время для адаптации к новым  условиям. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от  имевшихся в предшествующей культуре, то адаптация к новым условиям может  потребовать синтеза новых ферментов, в которых ранее не было  необходимости.
Экспоненциальная фаза роста бактерий (логарифмическая) характеризуется максимальной скоростью клеточного деления. Для конкретного вида бактерий в конкретных условиях роста время генерации (то есть время, необходимое для удвоения количества бактерий) постоянно в течение всей логарифмической фазы, но вариабельно у различных видов и штаммов, а также зависит oт состава среды и условий культивирования. Время генерации на оптимальной среде может был коротким (у кишечной палочки 20 мин), либо продолжительным (у Mycobacterium tuberculosais 6 ч). В этой фазе в среде происходит максимальное накопление метаболитов бактерий (например, токсинов, бактериоцинов).
Стационарная фаза роста бактерий. В течение этого периода  доступность важнейших питательных веществ становится лимитирующим  фактором. Устанавливается равновесие между клеточным ростом и делением и  процессом отмирания клеток. Спорообразующие бактерии (например родов  Bacillus и Clostridium) способны переходить в фазу споруляции,  активирующуюся при нахождении бактерий в условия ограниченного питания. В  определённый момент соотношение отмирающих, вновь образующихся и  покоящихся клеток становится стабильным; подобное состояние известно как  максимальная стационарная фаза. Биомасса бактерий в стационарной фазе  обозначают как «урожай», или «выход биомассы» (разница между  максимальной и исходной биомассой); или «экономический коэффициент»,  если прирост биомассы отнесён к единице лимитирующего рост субстрата.
Фаза отмирания (спада, лизиса) включает период  логарифмической гибели, переходящий в период уменьшения скорости  отмирания бактерий. Причины гибели бактерий в нормальных питательных  средах до конца не ясны. Понятны случаи, когда в среде накапливаются  кислоты (при росте Escherichia, Lactobacillus). Иногда бактерии  разрушаются под действием собственных ферментов (аутолиз). Скорость  отмирания широко варьирует в зависимости от условий обитания и  особенностей микроорганизма (например, энтеробактерии отмирают медленно,  а бациллы — быстро).