ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИГРАЮТ ВАЖНУЮ РОЛЬ В УСТАНОВЛЕНИИ ДИАГНОЗА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ, НАЗНАЧЕНИИ ЭТИОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ, ПРОВЕДЕНИИ КОНТРОЛЯ ЗА ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ ЛЕЧЕНИЯ. ПРОЦЕСС СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСНОВАН НА ВЫЯВЛЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ И ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА В ХОДЕ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА. ОН СОСТОИТ ИЗ ТРЕХ ЭТАПОВ: СБОРА МАТЕРИАЛА, ТРАНСПОРТИРОВКИ И ЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ В ЛАБОРАТОРИИ. К ПРОВЕДЕНИЮ КАЖДОГО ЭТАПА ПРЕДЪЯВЛЯЮТ ОПРЕДЕЛЕННЫЕ ТРЕБОВАНИЯ, ОТ СОБЛЮДЕНИЯ КОТОРЫХ ЗАВИСИТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ. ЗАДАЧА ВРАЧА ЗАКЛЮЧАЕТСЯ В ПРАВИЛЬНОМ ВЫБОРЕ МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ И ГРАМОТНОЙ ОЦЕНКЕ ЕГО РЕЗУЛЬТАТОВ.
ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ РАЗЛИЧНЫ ПО ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕТОДА ОТРАЖАЕТ ВЕРОЯТНОСТЬ ТОГО, ЧТО РЕЗУЛЬТАТ ТЕСТА БУДЕТ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ У ИНФИЦИРОВАННОГО ПАЦИЕНТА И ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ОТНОШЕНИЕМ ОБЩЕГО ЧИСЛА ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ К ОБЩЕМУ ЧИСЛУ ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ. ЧЕМ ВЫШЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ТЕСТА, ТЕМ МЕНЬШЕ ВЕРОЯТНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ ЛОЖНООТРИЦАТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. КРИТЕРИЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ОТРАЖАЕТ ВЕРОЯТНОСТЬ ТОГО, ЧТО РЕЗУЛЬТАТ ТЕСТА БУДЕТ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ У НЕИНФИЦИРОВАННОГО ПАЦИЕНТА, И ЕГО ВЫЧИСЛЯЮТ КАК ОТНОШЕНИЕ ОБЩЕГО ЧИСЛА ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ К ОБЩЕМУ ЧИСЛУ НЕИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ. ЧЕМ МЕНЬШЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬ, ТЕМ БОЛЬШЕ ВЕРОЯТНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. ОБА ПОКАЗАТЕЛЯ ВЫРАЖАЮТ В ПРОЦЕНТАХ.Бактериоскопический метод диагностики основан на обнаружении возбудителей в биологическом материале. Используют светооптическую и электронную микроскопию.
Диагностика инфекционных болезней бактериальной, протозойной этиологии и, реже, вирусных болезней.
Имеет значение ускоренной ориентировочной диагностики.
Основными задачами микроскопии служат :выявление возбудителя в клиническом материале, ориентировочная идентификация на основании определения характерных морфологических и тинкториальных признаков бактерий, а также изучение окрашенных мазков из колоний чистых культур.
Материалом для микроскопического исследования могут быть : кровь, костный мозг, ликвор, пунктаты лимфатических узлов, фекалии, дуоденальное содержимое и желчь, моча, мокрота и т.д.
Для обнаружения «кровепаразитов», например простейших (малярийные плазмодии, трипаносомы, лейшмании, бабезии) и гельминтов (микрофилярии), исследуют препараты «тонкий мазок» и/или «толстая капля» крови.
К микроскопическим методам исследования относят иммунофлюоресценцию (РИФ) - антитела, меченные флюоресцирующим красителем.
Эффективность микроскопического метода определяется его чувствительностью и специфичностью. Специфичность ограничивается возможной ошибочной идентификацией возбудителя из-за артефактов.
Количественная оценка микрофлоры в мазке, а также выявление микробных ассоциаций важны в случае необходимости определения этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. Известно, что максимальная определяемая концентрация бактерий в мазке из нативного материала составляет 1Сг клеток в 1 мл.
Для большинства видов исследуемого материала этиологически значимым считается обнаружение условно-патогенных бактерий определенного вида в концентрации не менее 105—106 клеток в 1 мл, поэтому чувствительность микроскопического метода в большинстве случаев удовлетворяет потребностям клинической микробиологии.
Применение
бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах (кроме хламидий и риккетсий), поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.
В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам.
К основным требованиям, предъявляемым к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования, относят:
• взятие материала до начала этиотропного лечения;
• соблюдение условий стерильности при сборе материала;
• техническую правильность сбора материала;
• достаточное количество материала;
• обеспечение температурного режима хранения и транспортировки материала;
• сведение к минимальному промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.
Транспортировка материала в лабораторию - не более чем в течение 1—2 ч после его взятия.
Пробы материала должны находиться при определенном температурном режиме.
Кровь для исследования - в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3—4 пробы крови, взятые с интервалом 4—6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры . Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови.
Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1—2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1—2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С.
Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3—5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.
Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3—5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи.
Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.
Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20—50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами — лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.).
Мокрота. Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.
Промывные воды бронхов. При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.
Отделяемое глотки, ротовой полости и носа. Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, беря материал разными тампонами.
Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя.
Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют, т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде.
Биологический метод состоит в заражении различным материалом (клиническим, лабораторным) лабораторных животных для индикации возбудителя, а также для определения некоторых свойств микроорганизмов, характеризующих их патогенность (токсигенность, токсичность, вирулентность). В качестве лабораторных животных используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов и др.
Воспроизведение заболевания у животного — абсолютное доказательство патогенности выделенного микроорганизма (в случае бешенства, столбняка и др.). Поэтому биологическая проба на животных является ценным и достоверным диагностическим методом, особенно при тех инфекциях, возбудители которых в исследуемых биологических средах организма человека содержатся в малых концентрациях и плохо или медленно растут на искусственных средах.
Серологический метод включает исследования сыворотки крови, а также других биологических субстратов для выявления специфических антител и антигенов. Классическая серодиагностика основана на определении антител к выявленному или предполагаемому возбудителю. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в исследуемой сыворотке крови антител к антигенам возбудителя, отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Обнаружения в исследуемой сыворотке крови антител к возбудителю ряда инфекционных болезней недостаточно для постановки диагноза, поскольку оно может отражать наличие постинфекционного или поствакцинального иммунитета, поэтому исследуют «парные» сыворотки крови, первую, взятую в первые дни болезни, и вторую, взятую с интервалом 7—10 дней. В этом случае оценивают динамику нарастания уровня антител.
Диагностически значимо увеличение титра антител в исследуемой сыворотке крови не менее чем в 4 раза относительно первоначального уровня. Этот феномен называют сероконверсией. При редких инфекционных болезнях, а также вирусных гепатитах, ВИЧ-инфекции и некоторых других факт наличия антител свидетельствует об инфицированности пациента и имеет диагностическое значение.
Кроме определения титра антител, при проведении серологических исследований можно установить изотип антител. Известно, что при первой встрече организма человека с возбудителем в остром периоде болезни выявляют более быстрое нарастание антител, принадлежащих к IgM, уровень которых, достигая максимального значения, затем снижается. В более поздние сроки болезни повышается количество IgG-антител, которые дольше сохраняются и определяются в периоде реконвалесценции. При повторной встрече с возбудителем благодаря иммунологической памяти реакции гуморального иммунитета проявляются более быстрой продукцией IgG-анти-тел, а антитела класса М вырабатываются в незначительном количестве. Обнаружение IgM-антител свидетельствует о наличии текущего инфекционного процесса, а наличие IgG-антител — о перенесенной в прошлом инфекции или поствакцинальном иммунитете.
Учитывая особенности первичного и вторичного иммунного ответа, анализ соотношения IgM- и IgG-антител позволяет в некоторых случаях дифференцировать стадию инфекционного процесса (разгар заболевания, реконвалесценция, рецидив). Например, в случае вирусного гепатита А (ГА) надежным методом диагностики служит определение анти-HAV IgM-антител в сыворотке крови. Их выявление свидетельствует о текущей или недавно возникшей HAV-инфекции.
Серологическое исследование для обнаружения антител при инфекционных заболеваниях является более доступным методом лабораторной диагностики, чем выделение возбудителя. Иногда положительная серологическая реакция служит единственным доказательством встречи и взаимодействия организма с возбудителем соответствующего инфекционного заболевания. Кроме того, ряд заболеваний со сходной клинической картиной (например, риккетсиозы, энтеровирусные инфекции) могут быть дифференцированы лишь серологически, что отражает значение серологических методов в диагностике инфекционных болезней.
Аллергологические методы диагностики бактерий
Сенсибилизирующей активностью обладает ограниченное количество бактериальных Аг. Поэтому метод кожных проб применяют лишь при диагностике туберкулёза, сапа, мелиоидоза, бруцеллёза и туляремии.
Молекулярно-биологический методМетоды ДНК-исследований позволяют осуществлять раннюю и более полную диагностику различных заболеваний, своевременно проводить дифференциальную диагностику и осуществлять контроль эффективности терапии. Они незаменимы в пренатальной диагностике наследственных заболеваний, позволяют проводить геномную дактилоскопию по следам крови, спермы и других тканей (выявление личности, отцовства и др.). Дополнительные возможности открываются при использовании методов генодиагностики для определения совместимости тканей по HLA-типированию первого и второго классов, значительно превосходящие по своим возможностям HLA — серотипирование лейкоцитов доноров и реципиентов. Активное развитие методов ДНК-диагностики и внедрение их в практику позволяют предположить, что недалек тот момент, когда эти методы значительно сузят круг задач более традиционных диагностических исследований, какими являются методы цитогенетики, а может, и вытеснят их из практической медицины в научную сферу.
В настоящее время имеется два направления ДНК-диагностики: гибридизационный анализ нуклеиновых кислот и диагностика с использованием полимеразной цепной реакции.
Методы молекулярной биологии получили развитие в 50-е годы XX столетия. Формальное начало — открытие наследственной трансформации бактерий под действием ДНК (1944) и расшифровка пространственной структуры ДНК (1953).
В 70-е годы для выявления инфекционного возбудителя или мутации использовали ДНК-зондовую детекцию, основанную на гибридизации специфических олигонуклеотидных зондов, меченных радиоактивным изотопом (или флюорохромом) с образцом выделенной ДНК. Гибридизационный анализ использует способность нуклеиновых кислот в определенных условиях образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми же кислотами, имеющими комплементарные к ним последовательности. Метод детекции инфекционных возбудителей ДНК-гибридизацией оказался крайне трудоемким, длительным и дорогостоящим. На смену ему пришел метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Полимеразная цепная реакция — это изящный метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК.
Открытие метода полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет.
Впервые состав компонентов, входящих в реакционную смесь для постановки ПЦР, и основные принципы использования праймеров (коротких, искусственно синтезированных молекул ДНК) для получения копий ДНК были описаны Kleppe с соавт. в 1971 г. Однако не была подчеркнута основная особенность ПЦР — экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК.
Первое сообщение о современной ПЦР было опубликовано сотрудником корпорации «Cetus» Kary Mullis и соавторами в 1985 г. в журнале «Science». Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК в миллионы раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.
----------------------
Метод ПЦР был разработан американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 г. на основе применения открытой им термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-полимеразы). Принцип метода состоит в увеличении в 106—108 раз числа копий специфического участка ДНК возбудителя, катализируемого in vitro ДНК-по-лимеразой в автоматическом режиме.
В искусственных условиях воспроизведение процесса репликации специфического для определенного вида или рода возбудителей участка генома возможно при условии знания его нуклеотидной последовательности. Применение методов детекции продуктов репликации таких участков (ампликонов) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе.
Описанное выше комплементарное достраивание цепей начинается только в определенных стартовых блоках, представляющих собой короткие двунитевые участки. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК процесс синтеза новой цепи направляется только в выбранном участке, а не по всей длине цепи ДНК. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олиго-нуклеотидные затравки, которые называют праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы так, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.
К достоинствам метода ПЦР следует отнести:
o высокую чувствительность, позволяющую определять 10—1000 клеток в пробе;
o высокую специфичность, поскольку в исследуемом материале выявляется уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК;
o универсальность процедуры обнаружения различных возбудителей из одной биопробы;
o высокую скорость анализа (4—4,5 ч);
o возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.
ПЦР эффективна для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов. Ее использование целесообразно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.
Применение ПЦР эффективно для диагностики широкого спектра бактериальных и вирусных инфекций.
В последнее время достаточно успешно реализуются количественные методы ПЦР-анализа, позволяющие определить концентрацию возбудителя в материале (микробную или вирусную нагрузку), например оценить репликативную активность вируса гепатита В, Си ВИЧ.
Однако следует иметь в виду, что метод ПЦР имеет и свои ограничения, в частности, для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенной аутофлорой.
Гибридизация нуклеиновых кислот, как и ПЦР, позволяет идентифицировать возбудителя в пробе без предварительного выделения. Для проведения анализа синтезируют одноцепочечный ДНК- или РНК-зонд, комплементарный специфическим нуклеотидным последовательностям возбудителя. Зонд метят радионуклидом, ферментом или другой легко распознаваемой меткой. Исследуемый материал подвергают обработке с целью лизиса микроорганизмов, находящихся в биопробе, выделения и денатурации ДНК. Далее проводят инкубацию зонда с исследуемым образцом и измерение количества меченой ДНК, вступившей в гибридизацию с ДНК, находящейся в исследуемой пробе. Реакция может происходить как на твердофазных сорбентах, так и в растворе, однако обязательным условием является отмывка несвязавшихся количеств меченого зонда. Чувствительность метода гибридизации нуклеиновых кислот уступает таковой ПЦР и составляет 103 микробных клеток в пробе.
Экспресс-диагностика Кроме мазка по Граму, в настоящее время существует несколько тестов экспресс-диагностики для быстрого выявления причинно-значимого возбудителя (точнее, его антигенов) - это экспресс-тест на выявление пневмококкового и легионеллезного антигенов в моче, экспресс-диагностика стрептококкового антигена в мазках с поверхности миндалин и/или задней стенки глотки. К сожалению, большинство тестов используется только за рубежом.
